Toksyczne sole żółciowe indukują apoptozę hepatocytów gryzoni poprzez bezpośrednią aktywację Fas czesc 4

Dane te, wykorzystujące komórki McNtcp.24, potwierdzają i rozszerzają nasze poprzednie obserwacje, że aktywność katepsyny B zwiększa się i przyczynia się do apoptozy za pośrednictwem żółci w pierwotnych hepatocytach szczura (8). Figura Aktywność askatryny B wzrasta podczas indukowanej przez GCDC apoptozy komórek McNtcp.24, a inhibitory katepsyny B zmniejszają apoptozę. Komórki inkubowano w samej pożywce lub z 50. M GCDC pod nieobecność lub w obecności 100. M FA-fmk (w całym doświadczeniu) lub 0,1. M CA-074-Me (wstępne traktowanie przez 10 minut przed dodaniem GCDC). Aktywność katepsyny B (a) mierzono w komórkach po 2 godzinach inkubacji z użyciem fluorogennego substratu VLK-CMAC, jak opisano w Methods. P <0,01 dla GCDC względem kontroli, GCDC plus FA-fmk, lub GCDC plus CA-074-Me według ANOVA. Apoptozę (b) oznaczono ilościowo po 2 godzinach inkubacji, jak opisano w Metodach. P <0,01 dla GCDC względem kontroli, GCDC plus FA-fmk, lub GCDC plus CA-074-Me według ANOVA. GCDC, glikocenodeoksycholan. Czy kaspazy są aktywowane w apoptozie za pośrednictwem soli żółciowej i czy hamowanie kaspazy zmniejsza apoptozę. Analiza immunoblot wykazała, że PARP i laminat B1, dwa substraty przecięte kaspazami w wielu modelach apoptozy, zostały również rozszczepione w komórkach McNtep.24 traktowanych GCDC (ryc. 2). Te wyniki sugerują, że oprócz katepsyny B, kaspazy są aktywowane w apoptozie hepatocytów indukowanej przez GCDC. Figura 2 Analiza immunoblotów pokazuje rozszczepienie PARP i laminatu B1. Komórki McNtpc.24 traktowano GCDC przez wskazany czas. Komórki HL-60 z i bez etopozydu pojawiają się po prawej stronie jako odpowiednio pozytywne i negatywne kontrole. Pojawienie się produktów trawienia 89-kDa i 45-kDa, odpowiednio PARP (na górze) i na laminacie B1 (na dole), jest charakterystyczne dla cięcia za pośrednictwem kaspazy. PARP, polimeraza poli (ADP-ryboza). Aby ocenić wkład aktywacji kaspazy w apoptozę indukowaną solą żółciową, początkowo próbowaliśmy określić wpływ inhibitorów kaspazy na apoptozę hepatocytów za pośrednictwem GCDC. Nieoczekiwanie stwierdziliśmy, że dostępne w handlu tetrapeptydowe inhibitory kaspazy DEVD-CHO, DEVD-fmk, YVAD-CHO i YVAD-fmk hamowały katepsynę B (tabela 1). Inhibitory ketonu fluorometylowego (fmk) hamowały katepsynę B z szybkością krzywoliniową, wskazując powolną początkową reakcję pomiędzy enzymem i inhibitorem, a następnie etap szybkiej transformacji. Przeciwnie, peptydowe aldehydy (CHO) hamowały katepsynę B z liniową szybkością, wskazując na szybką reakcję pomiędzy inhibitorem i enzymem. Chociaż DEVD-fmk i DEVD-CHO mają podobną siłę hamowania katepsyny B (stężenia mikromolowe), YVAD-fmk (stężenie nanomolowe) było silniejsze niż YVAD-CHO (stężenie mikromolowe) w hamowaniu katepsyny B. Ponieważ te związki hamowały katepsynę B, nie byliśmy w stanie ich użyć do określenia, czy kaspazy przyczyniają się do apoptozy za pośrednictwem żółci. Tabela Hamowanie katepsyny B przez syntetyczne inhibitory kaspazy oparte na tetrapeptydach. Alternatywnym podejściem było zastosowanie białka CrmA do hamowania kaspaz. Po sprawdzeniu, że CrmA nie hamuje aktywności katepsyny B in vitro (dane nie przedstawione), wykazaliśmy, że CrmA może być eksprymowany w komórkach McNtcp.24 (Fig. 3). Aby ustalić wykonalność przeprowadzenia badań populacji komórkowej, wydajność transfekcji komórek McNtcp.24 określono przy użyciu konstruktu GFP. Jak oceniono za pomocą cytometrii przepływowej,> 80% komórek McNtcp.24 można było przejściowo transfekować przy użyciu lipofektaminy (danych nie pokazano). Z powodu tej wysokiej skuteczności transfekcji, byliśmy w stanie określić wpływ CrmA na apoptozę bez izolowania transfekowanych komórek. Zaobserwowaliśmy, że apoptoza zależna od GCDC została zahamowana w komórkach McNtcp.24 transfekowanych CrmA (ryc. 3). Dane te potwierdzają interpretację, że oprócz katepsyny B, kaspazy przyczyniają się również do indukowanej przez GCDC apoptozy komórek McNtcp.24. Figura 3 Ekspresja CRMA zapobiega aktywacji katepsyny B i apoptozie w komórkach McNtcp.24 traktowanych GCDC. Przeciwnie, hamowanie aktywności katepsyny B nie zapobiega wzrostowi aktywności kaspazy 8. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji wektorem ekspresyjnym dla CrmA lub pustego wektora, komórki McNtcp.24 traktowano 50. M GCDC lub rozcieńczalnikiem. Po 2 godzinach inkubacji oceniano ilościowo apoptozę (a), jak opisano na Fig. 1. P <0,01 dla GCDC w porównaniu z kontrolą, CrmA lub GCDC plus CrmA. Wstawka pokazuje immunoblot demonstrujący ekspresję CrmA w transfekowanych komórkach. Aktywność katepsyny B (b) zmierzono po 2 godzinach inkubacji przy użyciu fluorogennego substratu VLK-CMAC. P <0,01 dla GCDC vs. kontrola, CrmA lub GCDC plus CrmA według ANOVA [hasła pokrewne: ośrodki terapii uzależnień, space tychy, właściwości olejku rycynowego ] [więcej w: kalkulator kalorii na mase, kalkulator zapotrzebowania kalorycznego na mase, odkwaszanie organizmu przepisy ]