Toksyczne sole żółciowe indukują apoptozę hepatocytów gryzoni poprzez bezpośrednią aktywację Fas cd

Analizę immunoblot dla CrmA przeprowadzono na komórkach McNtcp.24 poddanych lizie w obecności inhibitorów proteazy (kompletny koktajl inhibitorów proteazy, Boehringer-Mannheim Biochemica, Mannheim, Niemcy). Po elektroforezie w żelach zawierających 10% poliakryloamidu, polipeptydy przeniesiono na nitrocelulozę. Membranę blokowano 1% wagowo / objętościowym chudym mlekiem w 20 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,0, przez 30 minut, a następnie inkubowano przez 45 minut z rozcieńczeniem 1: 500 mysiej anty-CrmA. (PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA). Po płukaniu membrany inkubowano przez 30 minut z kozim anty-mysim IgG sprzężonym z peroksydazą (Santa Cruz Biochemicals, Santa Cruz, Kalifornia, USA) i ponownie przemyto. Związane przeciwciało wizualizowano stosując chemiluminescencyjny substrat (ECL, Amersham, Arlington Heights, Illinois, USA) i wystawiono na działanie filmu Kodak XAR5. Fas sieciowanie i immunoprecypitacja. Immunoprecypitację usieciowanego receptora Fas przeprowadzono zgodnie z opisem w literaturze (30, 31). W skrócie, komórki traktowano 2 mM 3,3a-ditiio-bis (propionianem sulfosukcynimidylu) (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA), rozszczepialnym środkiem sieciującym, w PBS przez 10 minut w temperaturze 4 ° C. Po wygaszeniu reakcji 10 mM octanem NH4 przez 5 minut w temperaturze 4 ° C, komórki przemyto PBS, zdrapano do ml PBS zawierającego 50 | jM leupeptyny, 25 | jM pepstatyny A, 2 mM PMSF i mM benzamidyny, i poddawani lizie przez sonikację. Po usunięciu szczątków komórkowych przez odwirowanie, przeprowadzono immunoprecypitację przez inkubację 0,5 mg supernatantu w ml PBS zawierającego pożądane stężenie chomiczego przeciwciała przeciw mysiej Fas (PharMingen) i 100 ul agarozy A / G białka (Santa Cruz Biochemicals ) w 4 ° C przez noc z mieszaniem. Polipeptydy wyeluowane przez wrzenie przez 5 min w 5x buforze do próbek Laemmli rozdzielono za pomocą 10% SDS-PAGE, przeniesiono na nitrocelulozę i przeniesiono do króliczej poliklonalnej anty-mysiej Fas (Santa Cruz Biochemicals), a następnie sprzężonej z peroksydazą koziej anty-króliczej IgG. (BioSource International, Camarillo, Kalifornia, USA). PCR odwrotnej transkryptazy dla ligandu Fas i Fas. Primers dla Fas były: sens, 5. TGA TGA GCA CAC CTT TGA TGA C; antysensowny, 5. ATT CTT CCC AGG ACA AAC CAA C. Primery dla ligandu Fas (FasL) były: sensowne, 5. ACC TTT AAA CTC ACC TTC C; antysensowny, 5. AAC ACC CCT CTT ATT TCT C. Całkowity komórkowy RNA izolowano przy użyciu odczynnika Trizol (GIBCO BRL). Po odwrotnej transkrypcji (32) produkt cDNA zamplifikowano za pomocą PCR. Próbki ogrzewano do 94 ° C przez 2 min, a następnie amplifikowano przez 35 cykli z następującymi czasami trwania cyklu: 94 ° C przez min, 59,7 ° C (Fas) lub 52,6 ° C (FasL) przez min i 72 ° C. przez min. PCR dehydrogenazy 3-fosforanu glicerolu-3-fosforanu przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (32). Zamplifikowane produkty (15 .l) rozdzielono na 1% żelu agarozowym, zabarwiono bromkiem etydyny i sfotografowano stosując ultrafioletowe (UV) podświetlenie. Produkty PCR sekwencjonowano stosując technologię barwnika terminatora. Analiza statystyczna. Wszystkie dane reprezentują co najmniej trzy niezależne eksperymenty i są wyrażone jako średnia. SEM, chyba że wskazano inaczej. Różnice między grupami porównano przy użyciu ANOVA dla powtarzanych pomiarów i testu post hoc Bonferroni w celu skorygowania wielokrotnych porównań. Materiały i odczynniki. DEVD-AMC i tetrapeptydowe inhibitory kaspazy Ac-Asp-Glu-Val-aldehyd kwasu asparaginowego (DEVD-CHO), fluorometyloketon (Ac-Asp-Glu-Val-asparaginowy kwas fluorometylowy (DEVD-fmk), Ac-Tyr-Val-Ala- aldehydem kwasu asparaginowego (YVAD-CHO) i fluorometyloketonem Ac-Tyr-Val-Ala-asparaginowym (YVAD-fmk) były Bachem Biosciences (King of Prussia, Pennsylvania, USA). GCDC (> 96% czystości w chromatografii cienkowarstwowej), katepsyna B i DAPI pochodziły z firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). IETD-AFC i FA-fmk otrzymano z Enzyme Systems Products (Dublin, California, USA). CA-074-Me otrzymano z Peptides International (Louisville, Kentucky, USA). VLK-CMAC pochodziło od Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA). Rekombinowane kaspazy 3, 6, 7 i 8 otrzymano z PharMingen. Wyniki Czy aktywowana jest katepsyna B podczas leczenia komórek McNtcp.24 za pomocą GCDC, a hamowanie katepsyny B zmniejsza apoptozę. Gdy aktywność katepsyny B była monitorowana w hodowanych komórkach przy użyciu digitalizowanej mikroskopii wideo, zaobserwowano pięciokrotny wzrost wewnątrzkomórkowej hydrolizy VLK-CMAC po traktowaniu 50. M GCDC przez dwie godziny (Fig. 1). Inhibitory katepsyny B FA-fmk i CA-074-Me zmniejszały zależne od GCDC zwiększenie aktywności katepsyny B i apoptozy w komórkach McNtcp.24 (ryc.
[hasła pokrewne: ile kalorii ma mozzarella, just fit, body space tychy ]
[przypisy: body space tychy, space tychy, medycyna pracy nysa ]