Toksyczne sole żółciowe indukują apoptozę hepatocytów gryzoni poprzez bezpośrednią aktywację Fas ad 7

Analizę immunoprecypitatu metodą Western blot przeprowadzono zgodnie z opisem w Methods. W celu potwierdzenia niezależnie pozornej indukowanej przez GCDC fasoligomeryzacji, komórki transfekowano DN FADD . GFP i badano po różnym traktowaniu (Fig. 9). Konstrukt ten koduje GFP poddany fuzji z DN FADD, skróconą cząsteczką sygnałową, która wiąże się z Fas, ale nie jest w stanie propagować sygnałów śmierci. W komórkach kontrolnych DN FADD . GFP wykazywał rozproszoną lokalizację cytosolową, jak w przypadku wcześniej opisanej mikroskopii konfokalnej (28). Leczenie indukowaną FasL indukowaną łatwo wykrywalną agregacją DN FADD. Podobnie, GCDC lub glikodeoksycholan, inna toksyczna sól żółciowa, wywołała agregację DN FADD. W przeciwieństwie do tego, ursodeoksycholan, nietoksyczna hydrofilowa sól żółciowa i staurosporyna, związek indukujący apoptozę niezależną od Fas lub kaspazy 8, nie spowodowały agregacji DN FADD (38). Wyniki te wskazują, że wiele toksycznych soli żółciowych indukuje sygnalizację Fas / FADD, podczas gdy nietoksyczne hydrofilowe sole żółciowe nie. Figura 9 Lokalizacja wewnątrzkomórkowa DN FADD. GFP w komórkach McNtcp.24. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji DN FADD . GFP, komórki były albo nietraktowane (kontrola) albo traktowane 10 ng / ml FasL, 50. M tauro-ursodeoksycholanu (TUDC), 50. M GCDC, 1. M staurosporyny (SP), lub 50. M glikodeoksycholanu (GDC) przez 4 godziny. Fluorescencję GFP zobrazowano za pomocą laserowej mikroskopii konfokalnej. Dyskusja W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że (a) hamowanie katepsyny B lub kaspaz osłabia apoptozę indukowaną przez GCDC; (b) hamowanie kaspaz zapobiega wzrostowi aktywności katepsyny B, ale hamowanie katepsyny B nie zapobiega aktywacji kaspazy; (c) zwiększona aktywność hydrolityczna kaspazy 8 towarzyszy leczeniu komórek McNtcp.24 za pomocą GCDC; (d) hepatocyty myszy Lpr z niedoborem Fas są oporne na apoptozę indukowaną GCDC; i (e) GCDC indukuje Fas oligomeryzację, agregację FADD i apoptozę w oczywistej nieobecności FasL. Te nowe obserwacje nie tylko umieszczają katepsynę B poniżej kaspazy 8 w apoptozie indukowanej solą żółciową, ale także sugerują, że aktywacja kaspazy 8 zachodzi przez zależną od Fas ścieżkę niezależną od FasL. Każda z tych obserwacji jest omówiona bardziej szczegółowo poniżej. Rozszczepienie PARP i laminatu B1 na fragmenty sygnaturowe sugerowało aktywację kaspaz 3 i 6 po leczeniu GCDC. Uważa się, że te kaspazy są aktywowane za pomocą kaspaz sygnalizacyjnych (13). Dlatego staraliśmy się zidentyfikować wyższą proteazę odpowiedzialną za zainicjowanie indukowanej przez GCDC kaskady apoptotycznej. Nasze wyniki sugerują, że kaspaza 8 może odgrywać tę rolę. Wniosek ten oparty jest na obserwowanym wzroście aktywności cięcia IETD-AFC i na hamowaniu indukowanej przez GCDC apoptozy przez CrmA, serpinę wirusową ospy krowiej, która silnie hamuje kaspazy 1, 4 i 8, ale nie kaspazy 3, 6, 7 i 10 (23, 39). W poprzednich doświadczeniach nie byliśmy w stanie znaleźć wzrostu aktywności kaspazy podczas apoptozy za pośrednictwem GCDC z użyciem fluorogennego substratu YVAD-AMC (5), eliminując w ten sposób kaspazy i 4 jako proteazę hamującą hamowanie CrmA, powodującą apoptozę w naszym układzie. Kaspaza 10, inna kaspaza sygnalizacyjna z domenami efektorowymi zakończonymi NH2, nie jest hamowana przez CrmA (39). Zatem, kaspaza 8 prawdopodobnie będzie kluczowym celem CrmA podczas apoptozy indukowanej przez sól żółciową. Oprócz kaspazy 8, katepsyna B wydawała się również aktywowana podczas indukowanej przez GCDC apoptozy hepatocytów. Kiedy próbowaliśmy przeprowadzić eksperymenty w celu ustalenia, czy katepsyna B znajduje się za kaspazą 8, zaobserwowaliśmy nieoczekiwane zahamowanie katepsyny B tetrapeptydowymi fluorometyloketonami i aldehydami zaprojektowanymi do selektywnego hamowania kaspaz. Chociaż Ki dla tych inhibitorów jest ponad 1000-krotnie niższe dla kaspazy 3 niż dla katepsyny B (Ki dla DEVD-CHO wynosi 0,35 nM w porównaniu z 1,3. M dla katepsyny B), te inhibitory są często stosowane w 50. 100. Zakres M w eksperymentach z użyciem nienaruszonych komórek. Do czasu poznania wewnątrzkomórkowych stężeń inhibitorów, nasze wyniki sugerują, że dane opierające się wyłącznie na zastosowaniu wysokich stężeń tych inhibitorów należy interpretować ostrożnie, ponieważ inhibitory mogą nie być tak selektywne, jak przypuszczano. W wyniku tych obserwacji wykorzystaliśmy CrmA do zbadania zależności między kaspazami a katepsyną B. Hamowanie kaspaz CrmA blokowało wzrost aktywności katepsyny B, podczas gdy hamowanie katepsyny B za pomocą FA-fmk lub CA-074-Me nie blokować aktywację kaspazy. Dane te sugerują, że katepsyna B znajduje się poniżej i być może zależna od aktywacji kaspazy 8. Zgodnie z tym modelem dodatkowe eksperymenty z użyciem hepatocytów z myszy z nokautem katepsyny B potwierdziły, że aktywacja kaspazy 8 nie wymaga katepsyny B, ale katepsyna B przyczynia się do apoptozy wywołanej solą żółciową (Gores, GJ, niepublikowane obserwacje). Mechanizm, za pomocą którego kaspaza 8 powoduje zwiększenie aktywności katepsyny B, jest obecnie nieznany
[przypisy: stosowanie tabletek antykoncepcyjnych, przepis na chleb bez zakwasu, zapotrzebowanie na białko ]
[więcej w: przepis na chleb bez zakwasu, choleryk z brooklynu cda, tabletki na nerwy bez recepty ]