Toksyczne sole żółciowe indukują apoptozę hepatocytów gryzoni poprzez bezpośrednią aktywację Fas ad 5

Aktywność kaspazy 8 (c) oceniano w lizatach otrzymanych z komórek McNtcp.24 inkubowanych w samej pożywce lub 50. M GCDC w 37 ° C w obecności 100. M FA-fmk lub 0,1. M CA-074-Me jako opisano na Fig. 1. P = NS dla GCDC vs. GCDC plus FA-fmk lub GCDC plus CA-074-Me. P <0,01 dla wszystkich komórek traktowanych GCDC w porównaniu z kontrolą. NS, nieistotne. Czy aktywność kaspazy i katepsyny B jest mechanistycznie związana w apoptozie hepatocytów za pośrednictwem GCDC. Gdyby kaspazy i katepsyna B były aktywowane w niezależnych równoległych szlakach, hamowanie którejkolwiek z nich nie zmniejszyłoby apoptozy. Obserwacja, że CrmA i inhibitory katepsyny B zmniejszają apoptozę, sugerują, że kaspazy i katepsyna B są połączone w liniowy szlak apoptotyczny. Aby przetestować tę hipotezę, określiliśmy wpływ CrmA na aktywność katepsyny B (ryc. 3). CrmA zapobiegał aktywacji katepsyny B. Przeciwnie, inhibitory katepsyny B nie znosiły cięcia PARP i laminatu B1 w komórkach traktowanych GCDC (dane nie pokazane). Ponadto inhibitory katepsyny B nie zapobiegały rozszczepianiu fluorogennego substratu kaspazy IETD-AFC (ryc. 3). Obserwacje te sugerują, że kaspazy i katepsyna B są połączone mechanistycznie w apoptozie za pośrednictwem żółci, z aktywacją katepsyny B występującą w dół. kaspazy (s) rozszczepiającej IETD-AFC. Czy kaspaza 8 aktywowana jest podczas leczenia komórek McNtcp.24 za pomocą GCDC. Obserwacja, że CrmA, który ma wysokie powinowactwo do kaspazy 8 (23), hamuje zależną od GCDC apoptozę komórek McNtcp.24, zwiększa możliwość aktywacji kaspazy 8 podczas leczenia GCDC. Obserwacja, że cytosol z komórek traktowanych GCDC przecina IETD-AFC (ryc. 3) zapewnia dodatkowe wsparcie dla tego widoku. Aby sprawdzić, czy IETD-AFC jest selektywny dla kaspazy 8, monitorowaliśmy cięcie substratów IETD-AFC i DEVD-AMC przez cztery rekombinowane kaspazy: 3, 6, 7 i 8. Oceniano cięcie DEVD-AMC, aby upewnić się, że enzymy były aktywne i ponieważ wartości szybkości katalizy (kcat) / Km dla kaspaz 3, 6 i 7 z tym substratem są znane (33). Rzeczywiście, nasze wartości kcat / Km dla rozszczepienia DEVD-AMC przez kaspazy 3, 6 i 7 były porównywalne z opublikowanymi wartościami (33). Kaspaza 8 hydrolizowała IETD-AFC wydajniej niż inne kaspazy, potwierdzając, że ten substrat jest nieco selektywnym substratem dla kaspazy 8 (tabela 2). Tabela 2 Opróżnianie IETD-AFC i DEVD-AMC przez oczyszczone kaspazy Następnie określiliśmy przebieg czasowy aktywacji hydrolitycznej aktywności IETD-AFC w ekstraktach cytosolowych z komórek McNtcp.24 traktowanych GCDC (ryc. 4). Aktywność cięcia IETD-AFC wzrosła czterokrotnie w ciągu dwóch godzin po leczeniu GCDC (p <0,01). Wielkość cięcia IETD-AFC obserwowana po traktowaniu komórek McNtcp.24 GCDC była praktycznie identyczna z obserwowaną po traktowaniu TNF-a. (28 ng / ml) plus aktynomycyna D (325 nM) (dane nie przedstawione), kombinacja, o której wiadomo, że indukuje apoptozę za pośrednictwem szlaku zależnego od kaspazy 8 (34). Tak więc, wielkość aktywności hydrolitycznej IETD-AFC obserwowanej w apoptozie zależnej od GCDC była porównywalna do ustalonego modelu apoptozy zależnego od kaspazy. Nie zaobserwowano wzrostu aktywności hydrolitycznej IETD-AFC w komórkach nietraktowanych lub transfekowanych CrmA (ryc. 4). Ponadto, po traktowaniu GCDC, izoformy 55- i 53-kDa prokaspazy 8 wykrywane przez analizę immunoblot zmniejszyły się o ~ 40% po dwóch godzinach, zgodnie z przetwarzaniem części dostępnej prokaspazy 8 na aktywne podjednostki (dane nie pokazane). Dane te wykazują wzrost aktywności proteazy kaspazy podobnej do aktywowanej przez CrmA 8p podczas indukowanej przez GCDC apoptozy hepatocytów. Figura 4 Zwiększone cięcie IETD-AFC w cytozolu z komórek McNtcp.24 traktowanych GCDC jest zmniejszone przez wcześniejszą transfekcję CrmA. Nietransfekowane komórki McNtcp.24 inkubowano pod nieobecność (kontrola, otwarte kwadraty) lub obecność 50 | jM GCDC (pełne kwadraty i pełne koła). Komórki transfekowano CrmA przez 48 h przed inkubacją w obecności GCDC (pełne kółka). Cytosol wytworzono w wybranych punktach czasowych i testowano pod kątem aktywności proteazy kaspazy 8a, stosując fluorogenny substrat IETD-AFC. W jaki sposób aktywowana jest kaspaza 8 podczas apoptozy hepatocytów za pośrednictwem GCDC. Ponieważ kaspaza 8 może być aktywowana przez wiązanie z FADD w indukowanym śmiercią kompleksie sygnałowym (DISC) w wielu modelach apoptozy, następnie testowaliśmy hipotezę, że apoptoza za pośrednictwem żółci zależy od interakcji DISC. Zastosowaliśmy białko MC159 wirusa mięty zakaźnej, które konkuruje z procaspazą 8 o wiązanie z FADD i tym samym zaburza DISC (27), aby zbadać tę możliwość. Przejściowa ekspresja MC159 zmniejszyła liczbę komórek APN traktowanych GCDC z 46%. 4,5% do 8%. 1,5% (p <0,01, ryc [podobne: kapsuła tychy, infekcja dróg moczowych objawy, tabletki na nerwy bez recepty ] [więcej w: apteczka pierwszej pomocy nie powinna zawierać, lekarz medycyny pracy nysa, ile kalorii ma mozzarella ]