TGF- przełącza się z supresora nowotworu na czynnik prometastatyczny w modelu progresji raka piersi czesc 4

Pozycje migracji endogennego TGF-. receptory (RI, RII i RIII) są wskazane. MW, masa cząsteczkowa. (b) fosforylacja fosforu i regulacja ekspresji genów. Komórki traktowano 2 ng / ml TGF-a. i oceniano za pomocą analizy Western blot dla zakresu fosforylacji Smad (w t = 15 minut) i wpływu na fibronektynę (FBN) i ekspresję c-Myc (w t = 24 godziny). W przypadku blotu c-Myc strzałka wskazuje pasmo c-Myc, a wypełniony kwadrat wskazuje niespecyficzny prążek. (c) Hamujący wzrost TGF-a1. Proliferację komórek w obecności wzrastających ilości TGF-pi oznaczono ilościowo przez wbudowanie 3H-tymidyny (związek). Wyniki są średnimi dla trzech oznaczeń znormalizowanych dla kontroli bez dodanego TGF-a. dla każdego rodzaju komórki. DNR blokuje TGF-. funkcjonować in vitro. Wszystkie cztery linie komórkowe transdukowano kontrolnym retrowirusem (CON) lub retrowirusem eksprymującym DNR i scharakteryzowano pod kątem TGF-a. odpowiedzi in vitro. Reprezentatywne wyniki z komórkami M-III pokazano na Fig. 2. Analiza Western blot lizatów całych komórek, z zastosowaniem przeciwciała anty-Myc Ab do wykrywania znakowanej DNR, wykazała prążek przy 40 kDa, wskazując, że rdzeniowe białko DNR o 29 kDa było ekspresjonowany i glikozylowany w transdukowanych komórkach (Figura 2a). Sieciowanie z ligandem liganda wykorzystujące znakowane 125I TGF-P1, a następnie immunoprecypitację z anty-Myc Ab, potwierdziło, że DNR trafił prawidłowo na powierzchnię komórki i był zdolny do wiązania TGF-a. (Figura 2b). Rysunek 2 Blokada TGF-. odpowiedzi in vitro przez transdukcję z DNR. (a) Ekspresja DNR w transdukowanych komórkach. Ekspresję DNR w transdukowanych komórkach M-III określono przez sondowanie analizy Western blot dla znacznika Myc na DNR. Białko a-aktynę stosowano do normalizacji. (b) Zdolność DNR do wiązania TGF-a. Komórki M-III znakowano za pomocą powinowactwa za pomocą 125I-TGF-pi. Po sieciowaniu lizaty poddano immunoprecypitacji za pomocą anty-Myc Ab dla wizualizacji ligandu związanego z DNR. (c) Wpływ DNR na fosforylację Smad przez TGF-a. Komórki M-III traktowano 5 ng / ml TGF-P przez różne czasy i ekspresję białka Smad i fosforylację analizowano metodą Western blot. P-Smad, fosfos-Smad. (d) Wpływ DNR na reakcje regulacji genów na TGF-pi. Komórki M-III traktowano 5 ng / ml TGF-Pl lub samym nośnikiem przez 18 godzin, i fibronektynę (FBN) i ekspresję c-Myc analizowano metodą Western blot. (e) Wpływ DNR na hamowanie wzrostu indukowane przez TGF-pi. Zahamowanie wzrostu w odpowiedzi na TGF-pi zmierzono przez wbudowanie [3H] -tymidyny. Wszystkie wyniki są średnie. SD dla trzech oznaczeń i są normalizowane do braku TGF-a kontrole dla każdej próbki. PAR, nietransdukowane macierzyste komórki M-III; Komórki CON, M-III transdukowane retrowirusem kontrolnym pLPCX; DNR, komórki M-III transdukowane pLPC-DNR. Następnie zbadaliśmy, czy konstrukt DNR może blokować fosforylację dalszych elementów sygnalizacyjnych rodziny Smad (2). Co ciekawe, ekspresja DNR miała tylko częściowy wpływ na fosforylację Smad2 i Smad3 we wczesnych punktach czasowych, ale powodowała bardziej kompletne blokowanie przez 18 godzin po dodaniu TGF-a. (Figura 2c). Pomimo tego pozornie niepełnego blokowania TGF-. transdukcja sygnału, DNR typowo zmniejsza indukcję fibronektyny i represję białka c-Myc przez TGF-a do około 15% obserwowanego w komórkach kontrolnych (rysunek 2d). Komórki DN-M-III były również w dużej mierze odporne na zahamowanie wzrostu, przy traktowaniu do 100 pM TGF-pi (Figura 2e). W niektórych doświadczeniach obserwowano całkowitą utratę odpowiedzi hamującej wzrost w pulach transdukowanych DNR komórek, podczas gdy w innych, lub w klonowanych transduktywach, pewną resztkową odpowiedź obserwowano przy wysokim TGF-a. stężenia (rysunek 2e i rysunek 3a). Zatem na ogół DNR zmniejszył się, ale nie całkowicie zablokował różne odpowiedzi biologiczne na TGF-y. Rycina 3Dcreased TGF-. reakcja zwiększa prawdopodobieństwo złośliwej konwersji przedmięśniowej linii komórkowej piersi M-II. (a) TGF-. reaktywność transduktantów M-II in vitro. Proliferację transduktantów M-II w obecności (+) i nieobecności (a) 2 ng / ml TGF-a1 określono przez inkorporację 3H-tymidyny. Wyniki są średnie. SD trzech oznaczeń i są normalizowane do braku TGF-. kontrolować w każdym przypadku. * P <0,01. (b) Kinetyka wzrostu guza. Pięciotygodniowe samice bezgrasiczych myszy nagich zaszczepiono podskórnie na każdym tylnym boku za pomocą retrowirusowo transdukowanych komórek M-II (5 x 106 komórek / miejsce, dziesięć miejsc na genotyp). (c) Histologia zmian utworzonych przez transduktanty M-II. Komórki M-II CON tworzyły torbielowate struktury przewodowe, podczas gdy MII-DNR tworzyły gruczołowe raki [więcej w: body space tychy, zapotrzebowanie na białko, space tychy ] [przypisy: just fit, justfit, kapsuła tychy ]