TGF- przełącza się z supresora nowotworu na czynnik prometastatyczny w modelu progresji raka piersi ad

Jeśli chodzi o raki w innych narządach, TGF-a poziomy zwiększają się miejscowo i układowo w zaawansowanych rakach piersi, szczególnie na wiodącym inwazyjnym brzegu nowotworu oraz w przerzutach (9. 12). Podwyższona ekspresja TGF-. wiąże się z postępem choroby i koreluje z dodatnim wynikiem przerzutów do węzłów i przerzutami, sugerując, że na tym późnym etapie TGF-a obecnie promuje progresję rakotwórczą (10, 11). W niniejszym badaniu mieliśmy dwa główne cele. Pierwszym było ustalenie związku przyczynowego pomiędzy zredukowanym TGF-a. reaktywność i progresję choroby obserwowaną w klinicznych próbkach piersi. Drugim było przetestowanie ważnej i bardziej ogólnej hipotezy, że TGF-. może przełączyć się z supresora nowotworu na czynnik prometastatyczny podczas przebiegu rakotwórczego w danej linii komórkowej. Aby to zrobić, wykorzystaliśmy unikatową serię ludzkich linii komórek nabłonka sutka reprezentujących cztery różne etapy procesu rakotwórczego. Wszystkie linie komórkowe są pochodnymi nieśmiertelnej, ale poza tym normalnej, linii komórkowej MCF10A, która pierwotnie pochodziła z łagodnej tkanki piersi od kobiety z chorobą włóknisto-torbową (13). Obejmują spektrum progresji od względnie normalnych komórek nabłonkowych sutka do wysoce złośliwych przerzutowych komórek rakowych (14, 15). Aby modelować zmniejszoną ekspresję T. RII, która jest widziana klinicznie, wprowadziliśmy dominującą ujemną TGF. R. receptora na wszystkie cztery linie komórkowe i zbadano wpływ na rakotwórczość in vivo. Nasze dane zdecydowanie potwierdzają hipotezę, że TGF-. przełącza się z supresora nowotworu na czynnik prometastatyczny podczas progresji raka piersi. Metody Linie komórkowe. Wszystkie linie komórkowe są pochodnymi nieśmiertelnej, ale poza tym prawidłową linią komórek nabłonka sutka MCF10A (13). Transfekcja MCF10A aktywowanym HRAS i selekcja za pomocą ksenoprzeszczepu dała linię komórkową MCF10AT1k.cl2, która daje początek zmianom przednowotworowym z potencjałem progresji nowotworowej (14). MCF10Ca1h i MCF10CA1a.cl1 uzyskano od okazjonalnych raków powstałych w wyniku ksenoprzeszczepów MCF10AT1k.cl2. MCF10Ca1h daje przeważnie dobrze zróżnicowane raki na ksenoprzeszczepach, podczas gdy MCF10Ca1a powoduje stosunkowo niezróżnicowane raki i przerzuty do płuc po wstrzyknięciu do żyły ogonowej (15). Dla uproszczenia, w niniejszym badaniu, odnosimy się do tych linii komórkowych jako MI do M-IV, a właściwości i wyprowadzanie tych komórek zestawiono w Tabeli 1. Linie komórkowe uzyskano od Freda Millera i Steven a Santnera z Barbara Ann Karmanos Cancer Institute. Komórki M-III i M-IV utrzymywano w DMEM / F-12 uzupełnionym 5% surowicą końską i 1% penicyliną / streptomycyną w 37 ° C, 5% CO2. Pożywka hodowlana dla MI i M-II była podobna, ale dodatkowo zawierała 10 .g / ml insuliny, 20 ng / ml EGF, 0,5 .g / ml hydrokortyzonu i 100 ng / ml toksyny cholery. Tabela Podsumowanie właściwości linii komórkowych pochodzących z MCF10A Transdukcja retrowirusowa. Ludzką sekwencję T. RII, pomiędzy nukleotydami i 656, powielono metodą PCR i zligowano z miejscami EcoRI / BamHI wektora pcDNA3.1-myc-HisB (+) (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA). Ta dominująca negatywna postać receptora (DNR) ze znacznikiem Myc-HisB została następnie zamplifikowana przez PCR i subklonowana do wektora proretroviral pLPCX (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, California, USA) w celu wygenerowania konstruktu prOrVrVr pLPC-DNR. Defektywny pod względem replikacji zakaźny retrowirus wygenerowano przez transfekcję plazmidów proretroviral do komórek A-BOSC (16). Wykładniczo rosnące MI po komórkach M-IV transdukowano retrowirusem kontrolnym pLPCX lub pLPC-DNR i utrzymywano w selekcji puromycyny (2 ug / ml) przez 5 dni. Eksperymenty in vivo przeprowadzono w ciągu 2-3 tygodni transdukcji przy użyciu puli transdukowanych komórek. Sieciowanie z powinowactwem do liganda, testy hamowania wzrostu i analiza Western blot. Do wykrywania powierzchni komórek TGF-a receptory, monowarstwy komórek przy konfluencji 70. 80% były sieciowane przez powinowactwo za pomocą znakowanego 100 pM 125I TGF-pi (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA), jak opisano poprzednio (17). Aby potwierdzić tożsamość DNR, niektóre znakowane próbki poddano immunoprecypitacji za pomocą anty-Myc Ab (Invitrogen Corp.) przed załadowaniem. Proliferacja komórek została określona przez włączenie 3H-tymidyny zasadniczo jak opisano (17). W przypadku Western blot, monowarstwy komórek przy konfluencji 30. 40% zostały przełączone z normalnej pożywki wzrostowej do DMEM / F-12 1% surowicy cielęcej przez 18 godzin, następnie komórki traktowano 5 ng / ml TGF-a. i zbierane w różnych punktach czasowych po leczeniu. Ab. S pochodzi z następujących źródeł: fibronektyny i aktyny, Santa Cruz Biotechnology Inc
[podobne: szlifowanie stali nierdzewnej, kapsuła tychy, przepis na chleb bez zakwasu ]
[hasła pokrewne: stosowanie tabletek antykoncepcyjnych, solarium tychy, bodyspace efekty ]