Selektywna aktywacja i znaczenie funkcjonalne p38 aktywowana mitogenem kinaza białkowa w neutrofilach stymulowanych lipopolisacharydami czesc 4

Wykresy przedstawiają średnie wartości i SEM z trzech kolejnych eksperymentów wyrażonych w arbitralnych jednostkach. ATF, aktywowany czynnik transkrypcyjny; LPS, lipopolisacharyd; MAPk, kinaza białkowa aktywowana mitogenem; MKK, kinaza MAPk. MKK4 i MKK6 nie pośredniczą w aktywacji p38 MAPk w stymulowanych LPS neutrofilach. W identycznych warunkach MKK4 był immunoprecypitowany z nietraktowanych i stymulowanych neutrofili. Wykrywalny wzrost fosforylacji MKK4 obserwowano w neutrofilach eksponowanych na LPS w porównaniu z niestymulowanymi komórkami (Fig. 2a). Jednak nie wystąpiła znacząca fosforylacja p38 MAPk przez MKK4, co określono przez inkorporację 32P do rhp38 MAPk (Fig. 2b). Z kolei nie zaobserwowano znaczącego wzrostu aktywności rhp38 MAPk, co określono na podstawie fosforylacji 32P ATF-2 (Fig. 2c). Figura 2 Połączona próba aktywacji MKK4. Neutrofile stymulowano LPS (100 ng / ml) przez 20 minut w 37 ° C. (a) Fosforylacja MKK4. W identycznych warunkach do eksperymentów przedstawionych na Fig. 1, MKK4 poddano immunoprecypitacji z lizatów komórkowych i poddano SDS-PAGE i analizie Western blot z przeciwciałem anty-fosforylowanym MKK4. Blot jest reprezentatywny dla trzech eksperymentów. (b) Aktywacja MKK4. Fosforylację 32P rhp38 MAPk z plam określono ilościowo za pomocą autoradiografii z ekranem fosforowym. Lizaty w nieobecności rhp38 MAPk (ścieżki i 2) porównywano z lizatami w obecności rhp38 MAPk (ścieżki 3 i 4) i kontrolą bez komórek w celu wykazania braku specyficznej aktywacji MKK4 w odpowiedzi na LPS, jak ustalono. przez fosforylowanie 32P rhp38 MAPk. (c) Sprzężona aktywacja rhp38 MAPk przez MKK4. Zdolność MKK4 do aktywacji rhp38 MAPk określono przez zdolność fosforylowanego rhp38 MAPk do fosforylowania substratu ATF-21-110. Lizaty pod nieobecność rhp38 MAPk (ścieżki i 2) stanowią wyjściową fosforylację ATF-21-110, podczas gdy lizaty w obecności rhp38 MAPk (ścieżki 3 i 4) wykazują niewielki wzrost fosforylacji ATF-21-110 przez sprzężona aktywacja rhp38 MAPk przez MKK4 w odpowiedzi na LPS. Kontrola wolna od komórek określa ilościowo wewnętrzną aktywność rhp38 MAPk i jest odpowiednikiem niestymulowanych i stymulowanych LPS lizatów na ścieżkach 3 i 4. Wykresy przedstawiają średnie wartości i SEM z trzech kolejnych eksperymentów wyrażonych w arbitralnych jednostkach. MKK6 jest również zdolny do silnej aktywacji p38 MAPk; jednak MKK6 (w przeciwieństwie do MKK3 i MKK4) wydaje się mieć wysoki stopień swoistości typu komórkowego (9, 19). Doniesiono (19), że w ludzkich leukocytach ekspresja genu MKK6 jest niewykrywalna, pomimo faktu, że cDNA kodujący MKK6 był pierwotnie wyizolowany z ludzkich komórek T. Analiza Western blot przeprowadzona na lizatach pełnokomórkowych neutrofilów przy użyciu panelu przeciwciał swoistych dla MKK6 (patrz Metody) nie wykryła białka w porównaniu z lizatami miocytów i monocytów (dane nie pokazane), co sugeruje, że MKK6 nie ulega konstytucyjnej ekspresji w ludzkich neutrofilach. Stymulacja LPS granulocytów obojętnochłonnych powoduje aktywację p38y, ale nie p38a, MAPk. Western blot lizatów neutrofili sondowano przeciwciałami przeciwko p38 p, p38 p i p38 p. Immunoblot z surowicą odpornościową skierowaną przeciwko peptydowi p38 o 19-zasadowym. wykazali pojedyncze pasmo o odpowiedniej masie cząsteczkowej. Identyfikacja tego zespołu jako p38. był wspierany przez selektywną analizę immunodepelacyjną lizatu neutrofili (ryc. 3a). Przeciwnie, immunoblotting z przeciwciałami przeciwko p38. i p38. nie udało się ujawnić obecności tych izoform (dane niepokazane). Nie można wykryć p38. i p38. wspiera wcześniejsze doniesienia o specyficzności tkankowej, jako wyrazie p38. i p38. mRNA jest pomijalny w obwodowych leukocytach (10). Figura 3 stymulacja LPS selektywnie aktywuje p38. MAPk, ale nie p38. MAPK. (a) Identyfikacja p38. MAPK w lizatach pełnokomórkowych neutrofili (WCL) metodą immunodepletacji. Lizat neutrofilowy poddano SDS-PAGE i Western blotting z anty peptydem p38. antysurowice (linia 1). Potwierdzenie tożsamości p38. Pasmo MAPk uzyskano przez immunoprecypitację p38. z lizatu, stosując oczyszczone anty-p38 o pełnej długości przeciwciało. Znaczący spadek w proponowanym p38. prążek obserwuje się po 6 godzinach (linia 2) i 12 godzinach (linia 3) immunodeplacji. (b) Immunoprecypitacja p38. i p38. MAPK. Neutrofile stymulowane LPS (100 ng / ml) przez 25 minut w 37 ° C (L), H2O2 (1 mM) przez 20 minut w 37 ° C (H) lub niestymulowane (U) zostały poddane lizie, a p38. i p38. MAPk poddano immunoprecypitacji i rozdzielono metodą SDS-PAGE. Western blot badano antysurowicą swoistą dla p38. i p38. MAPK w celu zademonstrowania równoważnych ilości immunoprecypitacji dla każdego badanego stanu
[patrz też: zapotrzebowanie na białko, odkwaszanie organizmu przepisy, tabletki na nerwy bez recepty ]
[patrz też: kapsuła tychy, body space tychy, space tychy ]