Selektywna aktywacja i znaczenie funkcjonalne p38 aktywowana mitogenem kinaza białkowa w neutrofilach stymulowanych lipopolisacharydami cd

Aktywność kinazy p38. i p38. MAPks badano na próbkach z immunoprecypitacją przez zdolność do fosforylowania ATF-21-110, jak opisano wcześniej (17). Testy MKK. Neutrofile poddano lizie buforem ekstraktu (5) i połączono z przeciwciałami anty-MKK3 lub anty-MKK4 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) do badań immunoprecypitacji. Związaną Sepharose zawieszono ponownie w 25 .l mieszaniny kinaz (17) zi bez rhp38 MAPk. Reakcje zakończono za pomocą 2 x buforu Laemmli i białka rozdzielono za pomocą 10% SDS-PAGE i analizowano za pomocą autoradiografii z ekranem fosforowym, z kwantyfikacją aktywności przez ImageQuant (Storm Optical Scanner, Molecular Dynamics, Sunnyvale, California, USA) i jakościową analizę obecność kinazy i fosforylacja przez immunoblotting. Przeciwciała użyte do sondowania dla MKK6 obejmowały MEK-6 (N-19) (K-19) (V-19) (Santa Cruz Biotechnology Inc.), antyfosfo MKK3 / MKK6 (New England Biolabs Inc., Beverly, Massachusetts). i anty-MKK6 (pełna długość), dobry prezent firmy Amgen Inc. (Boulder, Colorado, USA). Kwantyfikacja TNF-a mRNA za pomocą testu ochrony przed RNazą. RNA wyizolowano z 30 x 106 neutrofili za pomocą Trizol Reagent (GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland, USA), zgodnie z zaleceniami producenta, i dalej oczyszczono przez strącanie za pomocą LiCl. Test ochrony przed RNazą (RPA) przeprowadzono przy użyciu zestawu do zwielokrotniania RiboQuant (PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA). Dupleksy zabezpieczone RNazą rozdzielono na denaturujących żelach poliakryloamidowych i oznaczono ilościowo fosfimimagacją i autoradiografią. Wyniki Sprzężona aktywacja MKK3 i p38 MAPk w stymulowanych LPS neutrofilach. Ponieważ MKK3, MKK4 i MKK6 są zdolne do aktywacji p38 MAPk, najpierw określiliśmy, który z tych MKK aktywuje p38 MAPk w stymulowanej LPS neutrofilzie. Pobudzone granulocyty obojętnochłonne poddano lizie, a MKK3 odzyskano przez immunoprecypitację. Aktywację MKK3 określono przez jej fosforylację i jej zdolność do fosforylowania i aktywacji rhp38 MAPk. Jednoczesna ocena aktywacji rhp38 MAPk została określona poprzez jej zdolność do fosforylowania ATF-2. Immunoprecypitowany MKK3 inkubowano z rhp38 MAPk w obecności ATF-2 i [32P] ATP, a następnie rozdzielono za pomocą elektroforezy na żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE). Neutrofile stymulowane za pomocą LPS wykazały fosforylację MKK3 (Fig. 1a), która odpowiadała aktywacji MKK3, co oceniono na podstawie fosforylacji rhp38 MAPk (Fig. 1b). Aktywacja p38 MAPk wymaga specyficznej fosforylacji reszty Tyr182. Aby zatem wykazać, że fosforylacja rhp38 MAPk przez MKK3 była specyficzna, wymagana była ocena aktywacji rhp38 MAPk. Fosforylowanie rhp38 MAPk przez MKK3 spowodowało jego aktywację, jak wykazano przez zdolność fosforylowanego rhp38 MAPk do z kolei fosforylowania ATF-2 (Fig. 1c). Przywrócenie immunoblotu przeciwciałem anty-MKK3 potwierdziło, że równe ilości MKK3 były immunoprecypitowane w każdych warunkach (nie pokazano). Figura Połączona analiza aktywacji MKK3. Neutrofile stymulowano LPS (100 ng / ml) przez 20 minut w 37 ° C. (a) Fosforylacja MKK3. MKK3 poddano immunoprecypitacji z lizatów komórkowych stymulowanych LPS (L) lub niestymulowanych (U) neutrofili. Lizaty poddano SDS-PAGE i analizie Western blot z przeciwciałem anty-fosforylowanym MKK3. Wydaje się, że mieszanina wolna od komórek, która nie zawierała immunoprecypitatu MKK3, kontroluje wewnętrzną aktywność rhp38 MAPk. Blot jest reprezentatywny dla trzech eksperymentów. (b) Aktywacja MKK3. Fosforylację 32P rhp38 MAPk z plam określono ilościowo za pomocą autoradiografii z ekranem fosforowym. Lizaty pod nieobecność rhp38 MAPk (ścieżki i 2) porównywano z lizatami w obecności rhp38 MAPk (ścieżki 3 i 4) i kontrolą bez komórek w celu wykazania swoistej aktywacji MKK3 w odpowiedzi na LPS, co określono metodą fosforylacji 32P. z rhp38 MAPk. (c) Sprzężona aktywacja rhp38 MAPk przez aktywowany MKK3. Zdolność aktywowanego MKK3 do aktywacji rhp38 MAPk określono przez zdolność fosforylowanego rhp38 MAPk do fosforylowania substratu. ATF-21-110.32P fosforylację ATF-21-110 z plam określono ilościowo za pomocą autoradiografii z ekranem fosforowym. Lizaty pod nieobecność rhp38 MAPk (ścieżki i 2) stanowią wyjściową fosforylację ATF-21-110, podczas gdy lizaty w obecności rhp38 MAPk (ścieżki 3 i 4) wykazują zwiększoną fosforylację ATF-21-110 poprzez sprzężoną aktywację rhp38 MAPk przez aktywowany MKK3 w odpowiedzi na LPS. Kontrola wolna od komórek kwantyfikuje wewnętrzną aktywność rhp38 MAPk i jest odpowiednikiem niestymulowanego lizatu na ścieżce 3
[więcej w: bodyspace efekty, just fit, infekcja dróg moczowych objawy ]
[patrz też: bodyspace efekty, just fit, justfit ]