Selektywna aktywacja i znaczenie funkcjonalne p38 aktywowana mitogenem kinaza białkowa w neutrofilach stymulowanych lipopolisacharydami ad 7

Wpływ hamowania in vivo p38. MAPk na aktywacji NF-kB. Neutrofile zawieszano w obecności lub nieobecności SB203580 (10 (M) przez 60 min w 37 ° C, a następnie stymulowano LPS (100 ng / ml) przez 20 minut w 37 ° C lub pozostawiono niestymulowane. Ekstrakty jądrowe następnie przygotowano i analizowano w EMSA przy użyciu sondy oligonukleotydowej NF-kB. Ten blot reprezentuje trzy kolejne eksperymenty. (b) Brak bezpośredniego efektu SB203580 w kierunku wiązania NF-kB z jego pokrewną sekwencją. Ekstrakty jądrowe ze stymulowanych LPS neutrofili koinfekowano za pomocą SB203580 (100 | jM) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w mieszaninie wiążącej, przed analizą EMSA. Ten blot reprezentuje trzy kolejne eksperymenty. (c) Uwolnienie TNF-a w momencie aktywacji NF-kB. Ilość TNF-a uwolniony na 106 neutrofilów z próbek badanych w a wykreślono dla każdego warunku. Słupki przedstawiają średnią wartość i SEM dla TNF-a uwalnianie (na 106 neutrofili) z trzech niezależnych eksperymentów.EMSA, test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej; NF-kB, czynnik jądrowy-kappa B. Dyskusja Stymulacja ludzkich neutrofili o fizjologicznym stężeniu LPS w obecności białka wiążącego LPS (LBP) rozpoczyna się przez wiązanie CD14. Nasza grupa i inni (5, 20) wykazali indukowaną przez LPS aktywację p38 MAPk i późniejsze uwalnianie TNF-a. można prawie wyeliminować, blokując wiązanie LPS z CD14. Po związaniu kompleksu LPS . LBP z CD14, sygnał musi przechodzić przez błonę plazmatyczną poprzez towarzyszące błonowe białko, ponieważ CD14 nie ma komponentu wewnątrzkomórkowego. Ludzkie homologi receptora Toll w Drosophila są białkami transbłonowymi, które wydają się zdolne do takiej funkcji. Po transfekcji do linii komórkowych, receptor Toll-podobny (TLR) 2 promuje transdukcję sygnału LPS, która jest wzmacniana przez koekspresję CD14 (21). W opornych na LPS szczepach myszy C3H / HeJ i C57BL / 10ScCr niezdolność odpowiedzi na LPS przypisywano mutacjom w genie eksprymującym TLR4 (22). Rola receptorów TLR w szlaku sygnałowym LPS ludzkiej neutrofili nie została jeszcze ustalona. Chociaż wczesne sygnały wewnątrzkomórkowych sygnałów w tym szlaku pozostają niezdefiniowane, są one niezależne od kinazy białkowej C i nie wykorzystują Ras, Raf, MEKK-1 ani MEK1 / MEK2 (5). Zamiast tego, teraz pokazujemy, że indukowana przez LPS aktywacja p38 MAPk zachodzi poprzez MKK3 (niezależnie od MKK4 lub MKK6). Tylko p38. i p38. Izoformy MAPk wykryto w neutrofilach i tylko p38. stwierdzono, że jest aktywowany w odpowiedzi na LPS. Aktywacja p38. MAPk przyczynia się do odpowiedzi funkcjonalnych, w tym adhezji, aktywacji NF-kB i syntezy TNF-a. Dokładna rola p38. MAPk w złożonej serii zdarzeń prowadzących do adhezji neutrofilów nie jest znany, ale ponieważ adhezja zachodzi niezależnie od syntezy białek, ta regulacja prawdopodobnie obejmuje fosforylację różnych substratów niż te wpływające na uwalnianie TNF-a. Schemat przedstawiający nasze obecne rozumienie indukowanej przez LPS wewnątrzkomórkowej sygnalizacji w neutrofilach pokazano na Fig. 7. Figura 7 Pasek pokazujący proponowane wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe i funkcjonalne konsekwencje odpowiedzi na stymulację ludzkich neutrofilów LPS. Wiązanie CD14 przez LPS w obecności LBP inicjuje sygnał, który przechodzi przez białko transmembranowe obejmujące szereg nieznanych jeszcze sygnałów sygnalizacyjnych w górę strumienia, prowadząc do aktywacji MKK3a p38. Kaskada MAPK. Aktywator MKK3 w tej komórce (MEKK-X) nie jest znany. Aktywacja p38. MAPk powoduje następnie szybkie reakcje, takie jak adhezja i aktywacja NF-kB. Synteza TNF-a peptyd jest również zależny od p38. Aktywacja MAPk, częściowo poprzez aktywację NF-kB, ale głównie poprzez regulację translacji. LBS, białko wiążące lipopolisacharydy. Poprzez zastosowanie specyficznych inhibitorów p38 MAPk, takich jak SK & F 86002 i SB203580, kilka funkcjonalnych konsekwencji p38. Aktywacja MAPk została zidentyfikowana. Te pirydynyloimidazole zostały wykazane in vitro w celu zahamowania specyficznie. i . izoformy p38 MAP, o znikomym wpływie na inne ważne kinazy i fosfatazy białkowe (4, 11, 12, 17). Podobnie, badania in vivo w całych komórkach wykazały hamowanie p38 MAPk, bez wpływu na aktywację JNKs i p42 ERK MAPks (4, 12). Przy wyższych stężeniach może wystąpić hamowanie pewnych izoform JNK; jednak te kinazy nie są aktywowane przez LPS w neutrofilach w naszych warunkach eksperymentalnych (13). W ludzkich neutrofilach zahamowanie p38 MAPk powoduje zmniejszenie wytwarzania anionu ponadtlenkowego, zmniejszenie adhezji i chemotaksji w odpowiedzi na fMLP (17, 23) i niedrożność uwalniania interleukiny (IL) -8 w odpowiedzi na LPS (23). Nasze dane sugerują, że p38. Aktywacja MAPk może wpływać na co najmniej dwa etapy regulacyjne w syntezie TNF-a
[podobne: infekcja dróg moczowych objawy, space tychy, justfit ]
[więcej w: ile kalorii ma mozzarella, infekcja dróg moczowych objawy, ośrodki terapii uzależnień ]