Selektywna aktywacja i znaczenie funkcjonalne p38 aktywowana mitogenem kinaza białkowa w neutrofilach stymulowanych lipopolisacharydami ad 6

W związku z tym zbadaliśmy, czy p38. MAPk jest składową szlaku sygnałowego prowadzącego do TNF-a. uwalnianie w neutrofilach. Komórki traktowane zakresem stężeń SK i F86002 lub SB203580 następnie stymulowano LPS, a następnie oznaczano ilościowo TNF-a. uwalnianie przeprowadzono za pomocą testu immunoenzymatycznego związanego z enzymem. Oba inhibitory p38 MAPk zmniejszały w sposób zależny od dawki zdolność LPS do wywoływania sekrecji TNF-a. (Ryc. 4c). Biorąc pod uwagę fakt, że uwalnianie cytokin przez aktywowane neutrofile jest poprzedzone wzmocnioną syntezą białka de novo i ekspresją genu (16), następnie badaliśmy wpływ inhibitorów MAPk na mRNA i TNF-a. akumulacja białka w komórkach stymulowanych LPS. Aby ustalić, czy hamowanie p38. Aktywacja MAPk może modulować TNF-a Stałe poziomy mRNA w stymulowanych LPS neutrofilach, komórki zawieszono w obecności lub nieobecności SB203580 i stymulowano LPS przez 30 i 60 minut. TNF-. mRNA oznaczono ilościowo za pomocą RPA. Stymulacja za pomocą LPS wywołała znaczny wzrost TNF-a mRNA, który można wykryć już po 30 minutach po dodaniu LPS. Wstępne traktowanie komórek SB203580 powodowało 50% -60% hamowania indukowanego przez LPS TNF-a. nagromadzenie mRNA w 30-minutowym punkcie czasowym (ryc. 5, aib). Jednak ten efekt SB203580 na TNF-a mRNA był przejściowy: nie był już obserwowany przez 60 minut (Fig. 5, aib) lub w późniejszych czasach (nie pokazano). Aby ustalić, czy hamowanie p38. MAPk prowadziło do posttranslacyjnego bloku przetwarzania lub uwalniania TNF-a, określiliśmy ilościowo TNF-a związany z komórką. ze stymulowanych LPS komórek po zahamowaniu p38. MAPK. Wstępne traktowanie neutrofili SB20580 nie spowodowało wewnątrzkomórkowego lub związanego z błoną gromadzenia się TNF-a. (dane nie pokazane). Razem te wyniki wskazują, że hamowanie p38. MAPk reguluje w dół TNF-a wydanie, działając głównie na poziomie (lub wcześniejszym) tłumaczenia. Figura 5 Kwalifikacja TNF-a mRNA według RPA. (a) autoradiogram RPA z TNF-a mRNA po 0, 30 i 60 minutach po stymulacji LPS (100 ng / ml) w 37 ° C w obecności (+) i nieobecności (.) SB203580 (10 (M). Wzrost TNF-a mRNA widoczny po 30 minutach stymulacji (linia 3) jest zasadniczo zmniejszony w komórkach traktowanych SB203580 (linia 4). Po 60 minutach ilość TNF-a mRNA w nietraktowanych i traktowanych SB203580 komórkach (ścieżki 5 i 6) jest równoważny. Blot reprezentuje trzy kolejne eksperymenty. (b) Znormalizowany wykres TNF-a synteza mRNA określona ilościowo przez RPA. Ilość TNF-. mRNA obecny dla każdego warunku wyrażono jako frakcję GAPDH obecnego dla każdej próbki dla skorygowania potencjalnych różnic w obciążeniu próbek. Każdą wartość następnie normalizowano do ilości TNF-a. mRNA obecny po 30 minutach stymulacji LPS w nietraktowanych neutrofilach (linia 3) w celu skorygowania zmienności odpowiedzi między dawcami. Po 30 minutach stymulacji LPS, neutrofile traktowane SB203580 (zamknięty słupek) wykazały 42% TNF-a. mRNA obecny w komórkach nietraktowanych (kreskowany pasek). Po 60 minutach stymulacji nie obserwuje się znaczącej różnicy. Panel przedstawia wartości średnie i SEM z trzech kolejnych eksperymentów. (c) Uwolnienie TNF-a w badanych warunkach. TNF-. uwolniony z neutrofilów badanych w punkcie b został przetestowany. Ilość TNF-a uwalniane na 106 neutrofili wykreślono za każdym razem w obecności (zamknięte słupki) lub nieobecności (kreskowane kreski) SB203580. Panel przedstawia średnie wartości i SEM trzech kolejnych eksperymentów opisanych dla b. GAPDH, dehydrogenaza fosforanu gliceraldehydowego; RPA, test ochrony przed RNazą. Hamowanie p38. Aktywacja MAPk zapobiega aktywacji NF-kB w stymulowanych LPS neutrofilach. Stwierdzono, że stymulacja neutrofili za pomocą LPS prowadzi do aktywacji NF-kB (18), a ten czynnik transkrypcji jest znany z regulacji TNF-a. ekspresja genów w wielu typach komórek. W związku z tym zbadaliśmy, czy p38. Hamowanie MAPk może modulować aktywację NF-kB w neutrofilach. Komórki wstępnie traktowano SB203580, a następnie stymulowano LPS przed analizą ekstraktów jądrowych metodą EMSA. Aktywowana przez LPS aktywacja NF-kB była prawie całkowicie hamowana w neutrofilach wcześniej traktowanych inhibitorem p38 MAPk (ryc. 6a). Możliwość, że SB203580 może bezpośrednio wpływać na wiązanie NF-kB z naszą sondą NF-kB, została wykluczona, ponieważ inkubacja ekstraktów jądrowych z komórek traktowanych LPS w obecności SB203580 nie powodowała żadnej różnicy w aktywności wiązania DNA (fig. 6b). Hamowanie wywołanego LPS NF-kB przez SB 203580 może przyczyniać się do przejściowego zmniejszenia TNF-a. nagromadzenie mRNA obserwowano w stymulowanych LPS neutrofilach po wstępnej obróbce SB203580. Figura 6 Hamowanie aktywacji NF-kB przez indukowane przez SB203580 hamowanie p38. MAPK
[patrz też: apteczka pierwszej pomocy nie powinna zawierać, przepis na chleb bez zakwasu, lekarz medycyny pracy nysa ]
[przypisy: odkwaszanie organizmu przepisy, apteczka pierwszej pomocy nie powinna zawierać, lekarz medycyny pracy nysa ]