Selektywna aktywacja i znaczenie funkcjonalne p38 aktywowana mitogenem kinaza białkowa w neutrofilach stymulowanych lipopolisacharydami ad 5

Bloty b poddano reprotekcji przeciwciałem przeciw fosfotyrozynie zdolnym do reakcji z fosforylowanymi resztami tyrozyny zarówno z p38. i p38. MAPK. (d) Aktywacja p38. i p38. MAPK. Neutrofile poddane identycznym warunkom jak w b i c poddano lizie, a p38. i p38. MAPk był immunoprecypitowany i łączony z ATF-21-110 w obecności [32P] ATP. Peptyd poddano SDS-PAGE, a stopień fosforylacji 32P ATF-21-110 oceniano przez autoradiografię plam. Każdy panel reprezentuje trzy kolejne eksperymenty. Aktywacja i fosforylacja p38. i p38. oceniano jednocześnie w lizatach z neutrofili stymulowanych LPS lub H2O2. Zarówno p38. i p38. po stymulacji ulegały immunoprecypitacji z lizatów komórkowych i zostały rozdzielone przez SDS-PAGE. Western blot sondowany przeciwciałami przeciwko p38. i p38. wykazał równoważne ilości kinazy dla każdego stanu (Fig. 3b). Następnie bloty wypalono przeciwciałem zdolnym do wykrywania fosforylacji tyrozyny obu p38. i p38. (Ryc. 3c). Jak pokazano wcześniej, stymulacja za pomocą LPS lub H2O2 spowodowała znaczącą fosforylację p38. MAPK. W przeciwieństwie do LPS nie udało się fosforylować p38. MAPK. H2O2, silny aktywator p38. po transfekcji w linie komórkowe (10, 11) były zdolne do indukowania fosforylacji p38. w neutrofilu. Aktywacja p38. i p38. oznaczano przez immunoprecypitację każdej izoformy ze stymulowanych i niestymulowanych komórek i łączenie kinaz z ATF-2 (odpowiedni substrat dla obu) w obecności [32P] ATP. Odpowiadając na wzór fosforylacji tyrozyny, stymulacja za pomocą LPS nie aktywowała p38a, podczas gdy wykazano, że H2O2 jest silnym aktywatorem izoformy (Fig. 3d). Łącznie wyniki te sugerują, że w badanych warunkach p38. sam jest aktywowany w odpowiedzi na stymulację LPS neutrofili. Hamowanie p38 MAPk selektywnie moduluje szybkie odpowiedzi neutrofili na LPS. Wykazano, że pirydynyloimidazole, SK i F86002 i SB203580 hamują aktywność p38 MAPk z nieistotnym wpływem na inne kinaz sygnalizacyjnych ssaków (4, 11. 13,17). SB203580 jest teraz rozpoznawany jako hamujący tylko. i . izoformy p38 MAPk (11). Aby zidentyfikować odpowiedzi funkcjonalne na LPS, które zależą od p38. Aktywacja MAPk, neutrofile były wstępnie traktowane SK & F86002 lub SB203580, a następnie stymulowane za pomocą LPS. Zdolność neutrofili do składania F-aktyny wydaje się być w dużej mierze niezależna od p38. Aktywacja MAPk, bez efektu inhibitora, z wyjątkiem najwyższego badanego stężenia (ryc. 4a). Przeciwnie, wstępne traktowanie inhibitorami p38 MAPk powodowało znaczące, zależne od stężenia, zmniejszenie przylegania neutrofilów w odpowiedzi na LPS (Fig. 4b). Rysunek 4 Wpływ p38. Hamowanie MAPK indukowanych przez LPS szybkich odpowiedzi na neutrofile. Neutrofile zawieszone w SK & F86002 (otwarte słupki) lub SB203580 (wypełnione słupki) w zakresie stężeń przez 60 minut w 37 ° C następnie stymulowano za pomocą LPS (100 ng / ml) w 37 ° C. (a) Wpływ hamowania in vivo p38. MAPK na montażu aktyny. Powtarzalny wzrost względnego wskaźnika fluorescencji (RFI) stymulowanych LPS neutrofili (5 min) w porównaniu z niestymulowanymi komórkami wykreślono dla każdego stężenia SB203580. Wykres przedstawia średnią aktywność i SEM dla trzech niezależnych eksperymentów. Związek między stężeniem SB203580 a hamowaniem tworzenia aktyny nie był statystycznie istotny (P = 0,55). (b) Wpływ hamowania in vivo p38. MAPK na temat adhezji neutrofilów. Powtarzany wzrost adhezji stymulowanych LPS neutrofili (30 min) w porównaniu z niestymulowanymi komórkami wykreślono dla każdego stężenia inhibitora. Wykres przedstawia wartości średnie i SEM dla sześciu eksperymentów. Związek między stężeniami SK i F86002 lub SB203580 i hamowaniem adhezji jest znaczący (P <0,0001). (c) Wpływ p38. Hamowanie MAPK indukowanego przez LPS uwalniania TNF-a. Ilość TNF-a uwalniane na 106 neutrofili stymulowanych za pomocą LPS (120 min) wykreślono dla każdego stężenia inhibitora. Wykres przedstawia wartości średnie i SEM trzech kolejnych eksperymentów. Związek między stężeniami SK i F86002 lub SB203580 i hamowaniem TNF-a uwalnianie jest znaczące (P <0,0001). TNF, czynnik martwicy nowotworów. Hamowanie p38. Aktywacja MAPk obniża poziom TNF-a ekspresja i uwalnianie genów w stymulowanych LPS neutrofilach. Wykazano, że hamowanie p38 MAPk przez pirydynylo-imidazole zmniejsza TNF-a. uwalnianie w monocytach i pewnych liniach komórkowych (4) [hasła pokrewne: kapsuła tychy, odkwaszanie organizmu przepisy, justfit ] [więcej w: medycyna pracy nysa, kalkulator kalorii na mase, kalkulator zapotrzebowania kalorycznego na mase ]