Niehamujący mutant domeny rusztowania jaskini-1 wzmacnia syntezę NO pochodzącą z eNOS i rozszerzenie naczyń u myszy czesc 4

Oczyszczone eNOS inkubowano z ograniczającymi ilościami perełek powleczonych GST a Cav-1 (3 (+) lub suplementowanych nadmiarem rozpuszczalnego GSTaAlc-1 (++) lub nadmiaru rozpuszczalnego GSTyF92AAcc-1 (++) i aktywności NOS. kwantyfikowane. n = 5 w trzech powtórzeniach. * P <0,05. (C) Zależne od CaM / HSP90 przesunięcie wiązania eNOS z GSTA-Cav-1 i GST-F92A-Cav-1. eNOS (2 .g) i HSP90 (4 .g) inkubowano z perełkami pod nieobecność (a) lub obecność 0,01 (+) lub (++) .M CaM. Eksperymenty przeprowadzono trzykrotnie; typowe dane pokazane. (D) F92A (3-Cav-1 nie wpływa na jego kohezję lub handel (E) z eNOS. Lokalizacja WT Cav-1 (myc, góra) lub F92AA Cav-1 (HA, dół) była badana za pomocą mikroskopii konfokalnej z zastosowaniem anty-myc / HA (czerwony) lub anty-eNOS (zielony). Nuclei wizualizowano za pomocą DAPI (niebieski). Wstawka przedstawia brak barwienia myc lub HA w niezainfekowanych komórkach. n = 5 pojedynczych komórek. Pasek skali: 7 .m. (F) Zmniejszone uwalnianie ponadtlenku w BAECs zakażonych F92AA Cav-1. BAEC infekowano Ad-WT i Ad-F92AAcell-1 przez 48 godzin, a tworzenie nadtlenków oceniano przez redukcję cytochromu c. Western bloty przedstawiają ekspresję białka dla każdego stanu. (n = 7. 10; * P <0,05). Aby dodatkowo potwierdzić, że F92A (3-Cav-1 nie zakłóca innych właściwości eNOS, wyizolowaliśmy CEM w celu określenia lokalizacji subkomórkowej eNOS, jak również porównać kolonalizację eNOS z WT i F92AAc-Cav-1. eNOS wykazywał podobne wzbogacenie zarówno w CEM, jak iw ciężkich frakcjach błony komórkowej wyrażającej zarówno WT, jak i F92AA-Cav-la, co jest typowe dla tego enzymu zmodyfikowanego lipidami, który jest ukierunkowany na błony Golgiego i kaweoliny (Figura 3D). Lokalizacja eNOS za pomocą WT lub F92AAA Cav-1 w EC za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej wykazała, że eNOS i wyrażone WT (Figura 3E) i F92AAAlc-1 (Figura 3E) mają podobne wzory okołojądrowe (patrz poszczególne mikrografie w Suplementowej Figurze 1B) i kwantyfikacja obrazu nie ujawniła żadnych różnic w kolokalizacji pomiędzy WT lub F92AaAlc-1 z eNOS (Suplementowa Figura 1C), co oznacza, że podstawienie F92A nie powoduje błędnej lokalizacji Cav-1 lub endogennego eNOS. W warunkach sprzężonych, eNOS w dużej mierze wytwarza NO, ale przy ustawieniu zmienionego redoks, eNOS może wytworzyć anion ponadtlenkowy (O2a). W ten sposób ustalamy, czy F92A p Cav-1 wpływa na produkcję O2. w EC z zastosowaniem redukcji cytochromu c jako testu. Potwierdzenie O2. uwalnianie oceniano przez wstępną inkubację komórek z 4-hydroksy-2-nonenalem (14), co zwiększało O2. kilkakrotnie (nie pokazano). Zakażenie BAEC kodowanymi adenowirusami kodującymi WT lub F92A. Cav-lp ujawniło, że przy niższym MOI, nie było różnicy w podstawowym O2. wytworzone, ale przy wyższych poziomach MOI, ekspresja F92AA-Cav-1 zmniejszyła O2. wykrywanie (Figura 3F). Sugeruje to, że zwiększone uwalnianie NO w komórkach z nadekspresją F92AA-Cav-1 (3 wygasza podstawową produkcję O2. lub że F92AA-Cav-1 hamuje źródło generowania utleniacza. Cavnoxin zwiększa podstawowe uwalnianie NO z EC poprzez zmniejszenie interakcji eNOS / Cav-1. Wcześniej wykazaliśmy, że mutacja T90, T91, a w szczególności F92 do alaniny w Cavtratynie (peptyd połączony z antennapedi [APy] zawierający domenę rusztowania Cav-1, aa 82. 101) spowodowała utratę jego aktywność hamująca eNOS in vitro i in vivo po stymulacji agonistycznej (23). Dlatego przetestowaliśmy możliwość, że sprzężony z AP zmutowany domena peptyd zawierający substytucje T90 / 91 i F92A (zwany Cavnoxin) może zwiększać podstawowe uwalnianie NO in vitro. Inkubacja hodowanego EC z AP przez 6 godzin (0,1. 20. M) nie wpływała na uwalnianie NO, podczas gdy wstępne traktowanie Cavtratyną (10. M) zmniejszało uwalnianie NO. W tych warunkach Cavnoxin powodował zależne od dawki (do 1,9-krotnego) zwiększenie uwalniania NO w porównaniu z EC traktowanymi zaróbką (Figura 4A). Wstępne traktowanie żywych (nieutrwalonych) hodowanych EC za pomocą Cavnoxin znakowanego rhamaminą potwierdziło obfity zależny od czasu wychwyt komórkowy (Figura 4B, pokazana przez 6 godzin) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z żywymi komórkami. Nie zaobserwowano wychwytu przed 15 minutami inkubacji, co wskazuje na zależną od czasu internalizację Cavnoxinu (dane nie pokazane). Figura 4Cavoxin zwiększa uwalnianie NO i zmniejsza BP w sposób specyficzny dla eNOS. (A) Inkubacja EC ze wzrastającym stężeniem Cavnoxin zwiększa podstawowe uwalnianie NO (12 godzin) w porównaniu z peptydem kontrolnym (AP), podczas gdy inkubacja z Cavtratin hamuje uwalnianie NO [patrz też: just fit, zapalenie migdałków u dziecka, odkwaszanie organizmu przepisy ] [patrz też: kalkulator kalorii na mase, kalkulator zapotrzebowania kalorycznego na mase, odkwaszanie organizmu przepisy ]