Niehamujący mutant domeny rusztowania jaskini-1 wzmacnia syntezę NO pochodzącą z eNOS i rozszerzenie naczyń u myszy ad

Podobnie, Cavnoxin zwiększa uwalnianie EC NO, zmniejsza napięcie naczyń ex vivo i obniża BP u normalnych myszy. Efekty Cavnoxin są tracone w naczyniach z myszy z niedoborem eNOS i Cav-1 (3, co wskazuje, że efekty Cavnoxin. S są bardzo specyficzne. Mechanicznie, pokazujemy, że podstawienie F92A w Cav-1 nie wpływa na jego stan oligomeryzacji, lokalizację w komórce lub zdolność do interakcji z eNOS i że zarówno F92A (3A-Cav-1, jak i Cavnoxin działają jako. Dominujące negatywne. domeny rusztowania, tj. uwalniają eNOS od hamującego wpływu endogennego Cav-1. W świetle znaczenia endogennego NO dla homeostazy naczyniowej, nasze dane są pierwszymi, według naszej wiedzy, dostarczającymi bezpośrednich dowodów na zwiększenie uwalniania eNOS NO przez modulowanie interakcji eNOS / Cav-1 w warunkach podstawowych bez zakłócania podstawowych funkcji Cav-1 i sugerują, że modulowanie interakcji eNOS / Cav-1 może poprawić funkcję śródbłonka w chorobie naczyniowej. Wyniki Mutacja F92A Cav-1 zwiększa uwalnianie NO. Wcześniej wykazaliśmy, że podstawienie F92A w cDNA Cav-1 powoduje utratę aktywności hamującej eNOS w rekonstytuowanych komórkach (23). W celu dalszego przetestowania funkcji F92AA Cav-1 w EC, wygenerowaliśmy adenowirusy kodujące WT Cav-1 (myc tagged) i F92AA Cav-1 (znakowany HA) do infekcji do bydlęcej EC aorty (BAEC), która wykazuje poziomy endogennego eNOS i Cav-1. Infekcja konfluentnych EC z Ad WT Cav-1 (10 lub 50 MOI) nie zmniejszała podstawowego uwalniania NO (określanego ilościowo jako azotyn w podłożu przy użyciu analizatora chemiluminescencyjnego specyficznego dla NO; Figura 1A), co sugerowało optymalne podstawowe hamowanie eNOS przez endogenny Ekspresja Cav-1 w EC, która jest podobna do naszych obserwacji in vivo (24). Przeciwnie, zakażenie BAEC za pomocą Ad F92AA Cav-1 powodowało wzrost podstawowego uwalniania azotynu (Figura 1A) w obu MOI. Ekspresję endogennego i wyrażanego Cav-1 potwierdzono metodą Western blot z przeciwciałami anty-Cav-1, anty-Myc lub anty-HA. Figura 1F92AA-Cav-1 zwiększa uwalnianie NO. (A) Lewy panel pokazuje konfluentne BAEC zostały zainfekowane niskim (5 MOI) lub wysokim (50 MOI) oczyszczonymi adenowirusami, a nagromadzenie azotynów w pożywce zostało zmierzone po 16 godzinach przez chemiluminescencję specyficzną wobec NO. Ekspresję WT (znakowanego myc) i F92AA-Cav-1 (znakowany HA) potwierdzono metodą Western blotting. Dane są indywidualnymi wartościami azotynów na x 106 komórek i korelują z poniższymi danymi testu Western, przeprowadzonymi w trzech powtórzeniach. * P <0,001 w porównaniu z EC zakażonymi a-gal. Prawy panel pokazuje korelację obrazującą zwiększoną akumulację azotynów w komórkach eksprymujących F92A p Cav-1 w porównaniu z WT Cav-1 w funkcji ekspresji wirusowego Cav-1 (nagromadzenie azotynów na 1x106 komórek / AU eksprymowanego Cav-1). (B) Lewy panel pokazuje kotransfekcję cDNA F92AA Cav-1 z cDNA eNOS zwiększa akumulację azotynów w komórkach HEK293, podczas gdy kotransfekcja cDNA WT Cav-1 zmniejsza akumulację azotynów. Komórki transfekowano ustalonymi ilościami cDNA eNOS i wzrastającą ilością konstruktów Cav-znakowanych HA. Pokazano indywidualne wartości azotynów i korelację danych Western blot. * P <0,001 w porównaniu z komórkami wyrażającymi eNOS. Prawy panel pokazuje korelację obrazującą zwiększone i zmniejszone uwalnianie azotynów z komórek transfekowanych odpowiednio cDNA F92A lub WT Cav-1. Podobne eksperymenty powtórzono jeszcze 2 razy. W celu określenia mechanizmu odpowiedzialnego za wzrost uwalniania NO indukowanego przez F92AA Cav-1 w EC, stosowaliśmy rekonstruowane podejście systemowe w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych 293 (HEK293), które nie posiadają wszystkich izoform NOS. Transfekcja ludzkiego cDNA eNOS (heNOS) do komórek HEK zwiększyła podstawowe uwalnianie NO, potwierdzając syntezę NO pochodzącą z eNOS (Figura 1B). Niskie poziomy endogennego Cav-1 wykryto w komórkach HEK, a kotransfekcja ze wzrastającymi ilościami cDNA Cav-1 zmniejszała uwalnianie NO w sposób zależny od dawki, jak oczekiwano w tej linii komórkowej z niższymi endogennymi poziomami Cav-1 niż EC (fig. 1B). W przeciwieństwie do tego, kotransfekcja eNOS ze wzrastającymi ilościami F92A (3 Cav-1 powodowała zależny od dawki wzrost podstawowego poziomu uwalniania NO powyżej samego transfekowanego eNOS (Figura 1B). Analiza Western blot wykazała, że poziomy eNOS były niezmienione przez kotransfekcję WT lub F92A p.Cart-1, a ocena ilościowa ujawniła, że wpływ WT i F92AAAlc-1 na uwalnianie NO był zależny od ekspresji białka, ale był diametralnie przeciwny (Figura 1B). Mutacja F92A nie moduluje biochemicznych właściwości Cav-1. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób F92AAlc-1 zwiększa uwalnianie NO, ustaliliśmy, czy podstawienie F92A wpływa na kilka biochemicznych właściwości Cav-1 przez przeprowadzenie frakcjonowania gradientu sacharozy w celu wyizolowania mikrodomenek wzbogaconych w Cav-1. (CEM), a następnie niezależną analizę Cav- oligomeryzacja za pomocą analizy sedymentacji prędkościowej kompleksów molekularnych [hasła pokrewne: bodyspace efekty, space tychy, zapalenie migdałków u dziecka ] [patrz też: just fit, justfit, kapsuła tychy ]