Niehamujący mutant domeny rusztowania jaskini-1 wzmacnia syntezę NO pochodzącą z eNOS i rozszerzenie naczyń u myszy ad 5

Komórki inkubowano przez 6 godzin z peptydem (10 .M), płukano i wizualizowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Wyświetlane są typowe dane. Pasek skali: 20 m. (C) Zależnie od dawki Cavnoxin zmniejsza co-IP eNOS po Cav-1 IP w BAEC. Komórki pozostawiono nietraktowane (Ctrl) lub traktowano przez 6 godzin AP lub Cavnoxin (5. 10. M). Komórki poddano lizie i przeprowadzono Cav-1 IP, a następnie przeprowadzono blotting dla eNOS i Cav-1. Eksperymenty przeprowadzono trzykrotnie. (D) Cavnoxin (4 mg / kg, IP), ale nie AP (4 mg / kg) zmniejsza średnie BP u wyszkolonych, przytomnych myszy. Prawy panel pokazuje, że działanie Cavnoxin było zależne od dawki. Dane odzwierciedlają n = 4 myszy na grupę; * P <0,05 w porównaniu z wcześniejszą iniekcją. (E) Cavnoxin nie obniża BP u myszy eOOS KO. Eksperymenty były podobne do tych w D. Dane są średnie. SEM; n = 6 myszy. Aby potwierdzić, że wzrost uwalniania NO spowodowany przez Cavnoxin wynika z regulowanej interakcji eNOS / Cav-1, eksperymenty z co-IP przeprowadzono jak opisano uprzednio dla innych peptydów pochodzących od AP-Cav (23). Wstępne traktowanie EC za pomocą Cavnoxin (5. 10. M) zmniejszyło asocjację eNOS z endogennym Cav-1 w porównaniu z EC kontrolnymi i traktowanymi AP, jak określono przez immunoprecypitację Cav-1 i immunoblotting przeciwko eNOS (Figura 4C i określona ilościowo jako eNOS / Cav- stosunek). Dane te potwierdzają pogląd, że Cavnoxin może hamować interakcje między endogennym Cav-1 i eNOS. Cavnoxin zmniejsza zarówno BP, jak i napięcie naczyniowe w sposób zależny od eNOS. Ponieważ Cavtratin blokuje ostre zapalenie, wzrost nowotworu i inne choroby zapalne in vivo częściowo poprzez blokowanie uwalniania NO (20, 23, 26), staraliśmy się zbadać, czy Cavnoxin może wpływać na funkcję eNOS in vivo. Tak więc niezestresowane myszy C57BL / 6 podawano AP (jako kontrolę) i Cavnoxin (każda w 0,1, i 4 mg / kg) i mierzono BP. AP nie wpływał na parametry BP (Figura 4D), podczas gdy Cavnoxin zmniejszał ciśnienie krwi z efektem progowym pomiędzy 0,1 a mg / kg (Figura 4D). Aby ocenić swoistość wpływu Cavnoxin na BP i czy aktywacja eNOS jest niezbędna do obniżenia BP wpływu Cavnoxin, AP i Cavnoxin podano myszom eNOS KO. Jak widać na Figurze 4E, myszy eNOS KO są przewidywalnie nadciśnieniowe, a podawanie Cavnoxin nie obniżało BP, co pokazuje, że eNOS jest niezbędny do obniżenia BP działania peptydu. Aby potwierdzić naczyniową specyficzność działania Cavnoxiny, izolowano naczynia od myszy, inkubowano przez noc z peptydami (10 .M) i funkcją naczyniową oceniano bezpośrednio w mo- netografach. Cavnoxin, ale nie AP, zmniejszyła kurczliwość naczyń zależna od KCl i odpowiedź skurczową na. agonista receptora adrenoceptora, fenylefryna (PE) (Figura 4F). Wstępne traktowanie inhibitorem NOS, L-NAME, uratowało indukowane PE zwężenie o około 70%. 80%, wskazując, że działania peptydu były głównie zależne od NO (nie pokazano). Dowody genetyczne wykazują, że Cavnoxin wymaga zarówno eNOS, jak i endogennego Cav-1 do wpływania na napięcie naczyniowe. Przy założeniu, że wpływ Cavnoxin na uwalnianie EC NO, BP i napięcie naczyniowe zależą od zmniejszonego hamowania eNOS przez endogenny Cav-1, jego działanie powinno wymagać obecności zarówno Cav-1, jak i eNOS. Pierścienie aortalne wyizolowane od myszy WT lub Cav-1 KO inkubowano z AP lub Cavnoxin jak uprzednio i badano odpowiedzi naczyniowe na KCl i PE. Jak widać na Fig. 5A, krowianina zmniejszała indukowane agonistycznie napięcie w naczyniach WT, ale nie wpływała na tonację indukowaną przez KCl lub PE w naczyniach izolowanych od myszy Cav-1 KO (Figura 5B), dodatkowo potwierdzając, że wpływ na organizm naczyniowy wpływał na krowiantynę. ton jest poprzez regulowany antagonizm eNOS / Cav-1. Jednak Cav-1 ulega ekspresji zarówno w EC, jak i SMC. Aby potwierdzić eNOS i swoistość śródbłonka naczyniowego Cavnoxin, podobne eksperymenty przeprowadzono w pierścieniach aortalnych myszy zerowych eNOS, w których eNOS jest specyficznie wyrażany w pojedynczej warstwie śródbłonka. Jak pokazano na Figurze 5C, Cavnoxin nie wywierał działania w takich naczyniach. Razem, te dane pokazują, że efekt naczyniowy Cavnoxin jest Cav-1. oraz zależne od eNOS i potwierdzają brak bezpośredniego wpływu na kurczliwość SMC. W konsekwencji wydaje się, że F92A (3Ac-1 i Cavnoxin zmniejszają wiązanie eNOS i hamowanie przez endogenny Cav-1, przesuwając równowagę eNOS w kierunku niehamowanego lub mniej zahamowanego eNOS. i prowadząc do zwiększonego uwalniania NO i rozszerzania naczyń krwionośnych (jak podsumowano w modelu na Figurze 6). Figura 5Cavoxin reguluje napięcie naczyniowe w sposób zależny od eNOS i Cav-1 [patrz też: justfit, ośrodki terapii uzależnień, kalkulator kalorii na mase ] [więcej w: apteczka pierwszej pomocy nie powinna zawierać, lekarz medycyny pracy nysa, ile kalorii ma mozzarella ]