Toksyczne sole żółciowe indukują apoptozę hepatocytów gryzoni poprzez bezpośrednią aktywację Fas ad

Aby sprostać tym celom, hepatocyty poddano działaniu glikocenodeoksycholanu (GCDC), soli żółciowej, która gromadzi się wewnątrzwątrobowo podczas cholestazy i indukuje apoptozę hepatocytów w stężeniach patofizjologicznych (3, 5). Metody hodowli komórek McNtcp.24 i hepatocytów myszy. Linia komórkowa szczurzego McNtcp.24, która transportuje sole kwasów żółciowych i ulega apoptozie za pośrednictwem żółci w sposób podobny do pierwotnych hepatocytów szczura, hodowano jak opisano wcześniej (9). Hepatocyty myszy izolowano z myszy limfoproliferacyjnych (lpr) i typu dzikiego (MRLMPJ + / +) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA), oczyszczono przez wirowanie w gradiencie Percollu i hodowano jak opisano dla szczurzych hepatocytów (20). Żywotność izolowanych hepatocytów wynosiła zawsze> 95%. Kwantyfikacja aktywności katepsyny B i apoptozy. Jednokomórkową aktywność wewnątrzkomórkowej katepsyny B3 mierzono za pomocą fluorogennego substratu proteazy Z-Val-Leu-Lys-CMAC (VLK-CMAC) i digitalizowanej mikroskopii fluorescencyjnej, jak opisano poprzednio (9). Apoptozę oznaczono ilościowo przez ocenę zmian jądrowych przy użyciu dichlorowodorku 4., 6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) wiążącego wiązanie jądrowe i mikroskopii fluorescencyjnej (21). Testy enzymatyczne in vitro. Badania inhibitorów proteaz przeprowadzono w sposób opisany przez Thornberry i współpracowników (22). Pokrótce, testy katepsyny B rozpoczęto przez dodanie oczyszczonego enzymu do kuwet zawierających 20 mM buforu MOPS, pH 6,0, 20 | jM Z-Arg-Arg-AMC i pożądane stężenie inhibitora proteazy. Fluorescencję monitorowano w sposób ciągły za pomocą fluorometru LS 50 firmy Perkin-Elmer (Norwalk, Connecticut, USA). W przypadku tych inhibitorów, w których hamowanie było szybkie, prowadząc do liniowych szybkości wytwarzania produktu reakcji, Ki określono w sposób opisany przez Zhou et al i współpracowników (23). W przypadku tych inhibitorów o krzywoliniowych szybkościach wytwarzania produktu reakcji stałą szybkości drugiego rzędu określono w sposób opisany przez Morrisona (24). Po przygotowaniu ekstraktów cytozolowych, jak opisano (25), aktywność podobną do kaspazy 8p oceniano przez dodanie 50 ul cytozolu do 450 ul buforu zawierającego 25 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM DTT, 0,1% 3 – ([ 3-cholamidopropylo] -dimetyloamonio) -1-propanosulfonian (CHAPS), 0,5 mM PMSF, 100 U / ml aprotyniny (Trasylol) i 20 (3M IETD-AFC. Fluorescencję monitorowano jak opisano powyżej. Analiza kinetyczna hydrolizy IETD-AMC i DEVD-AFC przez rekombinowane kaspazy 3, 6, 7 i 8 została przeprowadzona w buforze 20 mM PIPES (pH 7,2) zawierającym 100 mM NaCl, 10 mM DTT, mM EDTA, 0,1% CHAPS, 10% sacharozy (26) i stężenia substratu w zakresie od do 100 .m. Po dodaniu rekombinowanej proteazy (100 ng / ml), fluorescencję monitorowano w sposób ciągły. Maksymalną prędkość maksymalną i maksymalną Vmax obliczono za pomocą programu Enzfitter (Erithacus Software, London, United Kingdom). Przejściowa transfekcja komórek McNtcp.24. Sekwencję kodującą CrmA wklonowano do wektora ekspresyjnego neomammalowego pCl (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Wektor ekspresyjny dla białka MCV 159, pCl-MC159, otrzymano od JI Cohen (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA) (27). pEGFP-Cl (Clontech Laboratories, Palo Alto, California, USA) zawiera sekwencję kodującą białko zielonej fluorescencji (GFP). Wektor ekspresyjny pcDNA3-GFP-aFADD, otrzymany od H. Wajanta (Stuttgart, Niemcy), koduje polipeptyd, który zawiera GFP poddany fuzji z końcową domeną śmierci domieszką Fas (FADD) na COOH (28). Konstrukt ten wiąże się z Fas, ale działa jako inhibitor dominujący-negatywny (DN), ponieważ nie posiada domeny efektorowej śmierci FDD końca NH2. Komórki McNtcp.24 (1,5 x 105 komórek / ml) transfekowano przy użyciu lipofektaminy (GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland, USA), jak opisano wcześniej szczegółowo przez nas (8). Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji żywotność transfekowanych komórek przez wykluczenie błękitem trypanu zawsze wynosiła> 95%. Skuteczność transfekcji określono przez transfekcję komórek za pomocą pEGFP-Cl i ocenę procentu komórek wykazujących ekspresję GFP za pomocą cytometrii przepływowej (FACStar Plus, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, California, USA). Mikroskopia konfokalna. Mikroskopię konfokalną komórek transfekowanych pcDNA3-GFP-PFADD . przeprowadzono przy użyciu laserowego mikroskopu konfokalnego (Axiovert 100M-LSM 310, Carl Zeiss Inc., Thornwood, New York, USA). Fluorescencję GFP obrazowano stosując długości fali wzbudzenia i emisji odpowiednio 488 nm i 505 nm. Analiza immunoblotowa. Analizę immunoblot dla lamininy B1 i polimerazy poli (ADP-rybozy) (PARP) przeprowadzono stosując lizaty całokomórkowe, jak opisali Martins i in.
[więcej w: bodyspace efekty, space tychy, just fit ]
[więcej w: just fit, justfit, kapsuła tychy ]