Toksyczne sole żółciowe indukują apoptozę hepatocytów gryzoni poprzez bezpośrednią aktywację Fas ad 6

Dane te sugerują, że apoptoza wywołana solą żółciową obejmuje oddziaływanie zależne od FADD / kaspazy 8p. W dalszym poparciu tej hipotezy zaobserwowaliśmy, że przejściowa transfekcja dominującym negatywnym konstruktem FADD (DN-FADD) hamuje także apoptozę indukowaną przez GCDC (ryc. 5). Figura 5MC159 lub DN FADD . GFP hamuje apoptozę w komórkach McNtcp.24 traktowanych GCDC. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji plazmidem kodującym MC159 (a) lub DN FADD. GFP (b), komórki McNtcp.24 traktowano 50. M GCDC lub rozcieńczalnikiem. We wskazanych punktach czasowych komórki barwiono DAPI i badano pod mikroskopem. W górnym panelu P <0,01 dla GCDC względem kontroli, wektor (pusty plazmid), MC159 lub MC159 plus GCDC według ANOVA; P = NS między GCDC a wektor plus GCDC. W dolnym panelu P <0,01 dla GFP plus GCDC vs. GFP, DN FADD. GFP lub DN FADD. GFP plus GCDC według ANOVA. DAPI, 4a, 6-diamidyno-2-fenyloindol; DN, dominujący negatywny; FADD, domena śmierci związana z Fas; GFP, białko fluorescencyjne. Ponieważ aktywacja receptora Fas jest typowym mechanizmem apoptozy zależnej od FADD / kaspazy 8a w wątrobie, ustaliliśmy, czy GCDC może indukować apoptozę w hepatocytach izolowanych z myszy lpr. Mysz lpr ma minimalną ekspresję Fas, a jej hepatocyty są odporne na apoptozę za pośrednictwem Fas (35, 36). Hepatocyty myszy wyizolowane z myszy lpr były wysoce oporne na apoptozę zależną od GCDC w porównaniu z myszami typu dzikiego (Fig. 6). Dane te silnie sugerują, że apoptoza indukowana przez GCDC zachodzi za pośrednictwem mechanizmu zależnego od Fas. Figura 6 Hepatocyty wyizolowane od myszy Lpr z niedoborem Fas są oporne na apoptozę indukowaną przez GCDC. Hepatocyty izolowane z myszy Lpr i typu dzikiego (Wt; MRLMPJ + / +) hodowano w pożywce przez 8 godzin przed dodaniem rozcieńczalnika lub 50. M GCDC przez kolejne 4 godziny. W 0, 2 i 4 godzinach inkubacji apoptozę oznaczono ilościowo morfologicznie (a), jak opisano na Fig. 1. Reprezentatywne fotomikrografie MRL i hepatocytów myszy Lpr traktowanych 50. M GCDC przez 2 h przed barwieniem DAPI (b). Zwróć uwagę na margines chromatyny / kondensację i fragmentację jądra w hepatocytach MRL i ich względny brak w hepatocytach lpr. Aby dodatkowo zbadać rolę szlaku Fas w apoptozie indukowanej solą żółciową, zbadaliśmy ekspresję Fas i FasL w komórkach McNtcp.24 stosowanych do pomiarów kaspazy 8. Odwrotna transkryptaza (RT) -PCR wykazała ekspresję mRNA Fas w komórkach McNtcp.24 (Fig. 7). Ponadto, komórki te uległy apoptozie w obecności egzogennie dodanego FasL (dane nie przedstawione), co pokazuje, że szlak przekazywania sygnałów Fas w tych komórkach jest nienaruszony. Chociaż komórki McNtcp.24 wyrażają Fas, nie eksprymują mRNA FasL, nawet po ekspozycji na GCDC (Fig. 7), podnosząc możliwość, że indukowana przez sól żółciowa aktywacja Fas może wystąpić w sposób niezależny od FasL. Figury komórek 7McNtcp.24 wyrażają receptor Fas, ale nie mRNA FasL. Po hodowli komórek McNtcp.24 przez 2 godziny w obecności lub nieobecności 50. M GCDC, wyizolowano całkowite RNA do późniejszego RT-PCR przy użyciu Fas, FasL i GAPDH. RNA z jelita krętego służyło jako kontrola pozytywna dla receptora Fas i FasL. Tożsamości produktów PCR zweryfikowano przez sekwencjonowanie DNA. FasL, ligand Fas; GAPDH, dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa; RT, odwrotna transkryptaza. Czy toksyczne sole żółciowe powodują Fas oligomeryzację i odpowiednią wewnątrzkomórkową agregację FADD. Ostatnie badania wykazały, że światło UV może indukować oligomeryzację w sposób niezależny od FasL (30, 31). Taką oligomeryzację można wykazać przez przeprowadzenie immunoprecypitacji z ograniczającymi ilościami przeciwciał anty-Fas (30, 31). W takich warunkach oligomeryzowany Fas strącany jest wydajniej niż monomer Fas (30, 31), prawdopodobnie dlatego, że Fas jest oligomeryzowany do makromolekularnych agregatów większych niż trimery (37). Gdy to podejście zastosowano do hepatocytów pierwotnych mysich McNtcp.24, ograniczenie ilości przeciwciał wytrąciło więcej Fas po leczeniu GCDC niż przedtem (Fig. 8). Wydajność immunoprecypitacji przy użyciu nadmiarowych ilości przeciwciał potwierdziła, że równe ilości białka Fas były obecne przed leczeniem GCDC i po nim (ryc. 8). W połączeniu z obserwacją, że mRNA FasL jest niewykrywalny w tych komórkach, wyniki te są zgodne z poglądem, że GCDC indukuje niezależną od liganda oligomeryzację Fas. Figura 8 Traktowanie GCCD pierwotnych mysich komórek hepatocytów prowadzi do oligomeryzacji receptora Fas. Nietraktowane i traktowane GCDC (50 .M) komórki inkubowano z odszczepialnym odczynnikiem 3,3 -ditiio-bis (propionian sulfosukcynimidylu) i poddawano lizie w celu immunoprecypitacji z zastosowaniem limitowania (0,5 .g / ml) lub nadmiaru (5 .l). g / ml) ilości przeciwciała anty-Fas [podobne: ile kalorii ma mozzarella, szlifowanie stali nierdzewnej, just fit ] [podobne: infekcja dróg moczowych objawy, ośrodki terapii uzależnień, właściwości olejku rycynowego ]