Tłumaczenie represji HIF2 ekspresja u myszy z Chuvash polycythemia odwraca czerwienicę ad 8

Ilość powstałej mieszaniny reakcyjnej wynosząca 20 ul została załadowana do 10% żelu akrylamid / TBE, który pracował przy 200 V przez 2,15 godziny, a żel utrwalono, wysuszono i wystawiono na autoradiografię. Ocenę ilościową przeprowadzono przy użyciu programu ImageQuant do analizy Western blot i przeciwciał w systemie Macintosh (GE Healthcare). Lizaty tkankowe przygotowano w beztlenowej komorze w pozbawionym tlenu buforze do lizy, zawierającym 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% dezoksycholanu sodu, 1% Triton X-100, mM PMSF, i Kompletna mieszanina inhibitorów proteaz bez EDTA. Analizę białka z beztlenowymi lizatami przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (53). Lizaty dodano do buforów do próbek w beztlenowej komorze do eksperymentów Western blot. Równe ilości białka (20. 50. G / ścieżkę) rozdzielono na 10% żelach SDS-PAGE i przeniesiono na membrany nitrocelulozowe. Membranę blokowano 5% beztłuszczowego mleka i 0,1% Triton X-100 w PBS i sondowano w temperaturze pokojowej w tym samym buforze blokującym. Przeciwciało IRP1 przygotowano wobec oczyszczonego ludzkiego IRP1 i stosowano w rozcieńczeniu 1: 5000. Hif2. Western blotting przeprowadzono z użyciem frakcji jądrowych z lizatów nerki po zebraniu nienaruszonych nerek w komorze azotowej i zlizywaniu tkanek w komorze beztlenowej. Hif2. przeciwciało (kozie anty-ludzkie oczyszczone przez powinowactwo) otrzymano z R & D Systems (katalog AF2886), a końcowe stężenie 1,0 ug / ml zastosowano zgodnie z opisem w protokole R & D Systems. Monoklonalne przeciwciało anty-aktyna (Sigma-Aldrich) zastosowano w rozcieńczeniu 1: 5000. Western bloty traktowano wtórnie sprzężonymi z peroksydazą kozimi anty-króliczymi IgG lub owczymi przeciwciałami skierowanymi przeciw przeciwciałom IgG (GE Healthcare) odpowiednio przy rozcieńczeniach 1: 5000 i 1: 2000. Statystyka. Dane są wyrażone jako średnia. SD. Porównania między dwiema grupami zanalizowano przy użyciu niesparowanego, 2-ogonowego testu t. Analizy wielu grup przeprowadzono przy użyciu zwykłej jednokierunkowej ANOVA (wielokrotne porównania). Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. Analizy statystyczne krzywych przeżycia myszy przeprowadzono za pomocą testu log-rank (Mantel-Cox) (porównanie krzywych) przy użyciu GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software). Zatwierdzenie badania. Wszystkie procedury z udziałem myszy przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez IACUC z NICHD (protokół 15-038) i spełniono wytyczne NIH dotyczące humanitarnej opieki nad zwierzętami. Wkłady autorskie. Projektantka zaprojektowała projekt, wykonała większość eksperymentów, przeanalizowała dane i napisała manuskrypt. DLZ przeprowadzał eksperymenty, analizował dane i sprawdzał manuskrypt. HO przeprowadzał eksperymenty i sprawdzał manuskrypt. MAE przeprowadził eksperymenty i przejrzał manuskrypt. TAR zaprojektował i nadzorował projekt i napisał manuskrypt. Materiały uzupełniające Zobacz Uzupełniające dane Podziękowania Niniejsza praca została wsparta przez program badań wewnętrznych NICHD Euniki Kennedy Shriver. Dziękujemy Peterowi Robbinsowi i Mary Slingo (University of Oxford) za dostarczenie heterozygotycznych myszy VhlR200W; Dan Crooks z National Cancer Institute (NCI) za wykonanie zimnego HIF2. GNIEW; Jorge Chavez z Wydziału Zasobów Weterynaryjnych do wykonywania niektórych pomiarów CBC i chemii surowicy; Michele D. Allen z Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi (NHLBI) za pomoc w mysiej komorze hipoksji; James B. Mitchell z NCI za wkład intelektualny i czytanie rękopisu; Anastasia Showers z NCI za pomoc w przygotowaniu żywności dietetycznej Tempol; oraz Marston Linehan z laboratorium NCI i laboratorium w Rouault za przyczynianie się do konstruktywnych dyskusji. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2018; 128 (4): 1317. 1325.https: //doi.org/10.1172/JCI97684.
[podobne: infekcja dróg moczowych objawy, żel pod prysznic bez sls, odkwaszanie organizmu przepisy ]
[przypisy: stosowanie tabletek antykoncepcyjnych, solarium tychy, bodyspace efekty ]