Tłumaczenie represji HIF2 ekspresja u myszy z Chuvash polycythemia odwraca czerwienicę ad 7

Zastosowaliśmy również hematoanalizator IDEXX w celu uzyskania wartości hematokrytu dla myszy WT i VhlR200W na diecie kontrolnej lub suplementowanej Tempol. Następnie wykorzystaliśmy testy ELISA do określenia poziomów EPO w surowicy, ponieważ stwierdzono, że zwiększona produkcja EPO powoduje erytrocytozę / czerwienicę u pacjentów z czerwienicą VhlR200W. Następnie oceniliśmy Hif2. poziomy przez Western blotting, ponieważ EPO jest celem Hif2 .. Od HIF2. ma IRE w swoim 5. -UTR, ocenialiśmy, czy Hif2. Aktywność wiązania Irpl w IRE była zwiększona u myszy VhlR200W z dodatkiem Tempol, wykonując testy przesunięcia ruchliwości RNA, znane również jako przesunięcie w żelu RNA lub testy pasmowo-RNA, po inkubacji lizatu komórek nerkowych z Hif2. GNIEW. Nie wykluczyliśmy żadnych danych. We wszystkich doświadczeniach zwierzęta były przydzielane losowo do różnych grup leczonych. W przypadku eksperymentu dotyczącego przeżycia (ryc. 5), wielkości próbek są określone w legendzie figur, a dla wszystkich innych eksperymentów wielkości prób są wskazane na rysunkach. W Uzupełniających Figurach 2. 4, rozmiary próbek są określone w każdej legendzie figur. Zwierząt. Myszy VhlR200W zostały pierwotnie wygenerowane przez Hickey i in. (14). Pary heterozygotyczne (C57BL / 6) (48) zostały dostarczone przez Mary Slingo i Petera A. Robbinsa (University of Oxford, Oxford, Wielka Brytania). Myszy odstawiono od piersi w wieku 3 do 4 tygodni, genotypowano jak opisano w Hickey i wsp. I utrzymywano na normalnej diecie NIH-07, o ile nie zaznaczono inaczej. W doświadczeniach z dietą, mioty z WT i VhlR200W umieszczano na diecie kontrolnej lub na tej samej diecie uzupełnionej Tempolem w wieku 6 do 8 tygodni i utrzymywano na tych dietach aż do eksperymentów. Irp1. /. myszy wytworzono jak opisano wcześniej (49, 50) i krzyżowano wstecznie z myszami C57BL / 6 przez 10 pokoleń. VhlR200WIrp1. /. myszy wytworzono przez pierwsze skrzyżowanie heterozygotycznych myszy VhlR200W (VhlR / +) z Irp1a /. myszy, a następnie hodowlę VhlR / + Irp + /. myszy. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z 5- do 8-miesięcznymi myszami, o ile nie zaznaczono inaczej. Myszy o różnych genotypach i różnych dietach dopasowywano wiekowo. Opis diety. Dietę Tempol przygotowano przez jednorodne mieszanie sproszkowanego Tempol (Sigma-Aldrich) z mysią karmą o smaku bekonu (Bio-Serv) techniką prasowania na zimno w stężeniu 10 mg / g pokarmu. Biszkoptowa karma bez Tempola była stosowana jako dieta kontrolna (29). Pomiar hematokrytu (metoda spinów kapilarnych). Około 100 .l krwi pobrano od każdej myszy przez krwawienie z żuchwy (z żyły twarzowej) do heparynowej rurki BD z mikrotawnikiem z heparyną litową. Probówki z hematokrytem napełniono w 80% krwią przez działanie kapilarne, zamknięto i odwirowano w wirówce mikematycznej (LW Scientific). Wartości hematokrytu mierzono za pomocą czytnika hematokrytowego. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie przedstawione dane hematokrytu zostały zmierzone przy użyciu metody spinów kapilarnych. Pomiar CBC. Około 100 .l krwi pobrano od każdej myszy przez krwawienie z żuchwy i umieszczono w rurce z heparyną. Hemoglobinę i poziomy RBC myszy w eksperymencie hipoksji (fig. 4, F i G) uzyskano z pomiaru CBC na analizatorze Hemavet 1500 (Drew Scientific). Wszystkie inne pomiary CBC przeprowadzono za pomocą analizatora hematologicznego IDEXX ProCyte Dx. Erytropoetyna w surowicy i oznaczanie ferrytyny w surowicy za pomocą testu ELISA. Erytropoetyna i ferrytyna zostały zmierzone w próbkach surowicy za pomocą zestawów ELISA odpowiednio od R & D Systems i Abcam, według producentów. protokoły. Przygotowanie tkanki i lizatu. Zwierzęta uśmiercono przy użyciu CO2, a tkanki zebrano natychmiast w komorze azotowej. Świeże tkanki zostały poddane lizie wewnątrz komory beztlenowej w buforze do lizy, który był odpowietrzany przez cykliczne zamrażanie-rozmrażanie i usuwanie powietrza argonem w celu stabilizacji Hif2 .. Test przesunięcia ruchliwości RNA. Test przesunięcia ruchliwości RNA przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (49). Lizaty tkankowe przygotowano w beztlenowej komorze, jak opisano w sekcji wytwarzania tkanki i lizatu, w zubożonym w tlen buforze do lizy zawierającym 10 mM HEPES (pH 7,2), 3 mM MgCl2, 40 mM KCl, 5% glicerolu, 0,2% nonidet P -40, 5 mM DTT, mM AEBSF, 10 .g / ml leupeptyny i kompletna mieszanina inhibitorów proteaz bez EDTA (Roche Applied Science). Lizat dodano w objętości zawierającej 10 .g całkowitego białka do buforu do zmieszania pasmowego zawierającego 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 40 mM KCl, z lub bez 2% P-merkaptoetanolu, związku chemicznego, który aktywuje Irp1 in vitro. Uzyskane roztwory próbek inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej z 12,5. L mieszaniny reakcyjnej zawierającej 20% glicerolu, 0,2 jednostki / yl Super RNAsine, 0,6. G /. transferowego RNA drożdży (tRNA), 5. M DTT i 20 nM wyznakowany 32P IRE z ludzkiego genu łańcucha H ferrytyny (51) lub 60 nM wyznakowanego 32P IRE z HIF2. gen (52) w 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 40 mM KCl
[więcej w: zapalenie migdałków u dziecka, space tychy, solarium tychy ]
[patrz też: choleryk z brooklynu cda, tabletki na nerwy bez recepty, żel pod prysznic bez sls ]