Selektywna aktywacja i znaczenie funkcjonalne p38 aktywowana mitogenem kinaza białkowa w neutrofilach stymulowanych lipopolisacharydami ad

Jako pojedynczy bodziec, LPS jest nieskuteczny w wywoływaniu chemokinezy, chemotaksji lub uwalniania anionu ponadtlenkowego lub enzymów ziarnistych. Reakcje funkcjonalne na LPS zależne od syntezy białek de novo polegają głównie na uwalnianiu cytokin (16). Postawiliśmy hipotezę, że neutrofile wykorzystują kaskadę p38 MAPk do łączenia prozapalnych bodźców z szeregiem odpowiedzi funkcjonalnych. Dodatkowa swoistość może wystąpić poprzez selektywną aktywację członków rodziny MKK i izoform p38 MAPk. Zbadaliśmy bezpośrednie zdarzenia sygnalizacyjne w górę strumienia, prowadzące do aktywacji p38 MAPk, względnej aktywacji czterech izoform p38 MAPk oraz konsekwencji funkcjonalnych aktywacji p38 MAPk po stymulacji LPS. Podaje się tu, że stymulacja neutrofili LPS poprzez CD14 inicjuje sygnał, który powoduje aktywację MKK3, który z kolei fosforyluje i aktywuje p38. MAPK. Stymulacja za pomocą LPS nie aktywowała p38. MAPk i p38. i p38. nie zostały wykryte. Po aktywacji p38. MAPk reguluje co najmniej trzy wyraźnie różne funkcje: adhezję, aktywację czynnika jądrowego-kappa B (NF-kB) i syntezę TNF-a. Te wyniki razem pogłębiają naszą wiedzę na temat wewnątrzkomórkowego szlaku sygnałowego wykorzystywanego przez ludzką neutrofil w odpowiedzi na LPS. Metody Materiały. Odczynniki wolne od endotoksyn i tworzywa sztuczne były używane we wszystkich eksperymentach. Neutrofile izolowano metodą plazmową Percoll (17) i ponownie zawieszano w buforze fosforanowym Krebsa-Ringera z 0,2% dekstrozą przy pH 7,2 lub w pożywce hodowlanej RPMI-1640 (BioWhittaker, Walkersville, Maryland, USA). Wszystkie eksperymenty wykonano w obecności 1% osocza ludzkiego pozbawionego płytek krwi inaktywowanego ciepłem. Aprotyninę, leupeptynę, Tris-HCl, Triton X-100, Igepal, PMSF, EDTA, EGTA, NP-40 i białko A-Sepharose zakupiono z Sigma Immunochemicals (St. Louis, Missouri, USA) i [. -32P. ] ATP zakupiono od Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, Illinois, USA). SK & F86002 i SB203580 zostały dostarczone przez SmithKline Beecham Pharmaceuticals (King of Prussia, Pennsylvania, USA). ATF-21-110 i rekombinowany ludzki p38 MAPk (rhp38 MAPk) przygotowano jak opisano wcześniej (5,17). Testy funkcjonalne neutrofilów. Przyleganie neutrofili i składanie aktyny po stymulacji LPS mierzono jak opisano wcześniej (17). Uwalnianie TNF-a oznaczono ilościowo za pomocą testu immunologicznego (R & D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Hamowanie in vivo p38 MAPk przeprowadzono przez inkubację neutrofili w zakresie stężeń SK i F86002 lub SB203580 przez 60 minut w 37 ° C. Analizę statystyczną istotności hamowania zależnego od stężenia dla każdej odpowiedzi funkcjonalnej przeprowadzono za pomocą średnich wartości grupy porównanych jednoczynnikową ANOVA. Przygotowanie ekstraktów jądrowych i test zmiany ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) w celu określenia aktywacji NF-kB przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (18). Przeciwciała izoformy P38 MAPk. Specyficzne przeciwciała przeciwko p38a, p38a, p38a i p38a i zrekombinowane białka dla każdego były dobrymi prezentami H. Lichenstein (Amgen Inc., Boulder, Colorado, USA). Poliklonalne antysurowice dla następujących peptydów przygotowano u królików: p38. (aa341. aa360), p38. (aa346. aa364), p38. (aa321. aa339) i p38. (aa262. aa280). Peptydy sprzęgano z hemocyjaniną skałoczepa i wstrzykiwano CFA. Królicze poliklonalne surowice odpornościowe również wytworzono do pełnej długości rekombinowanej flagi GST-p38. W badaniach immunoprecypitacji IgG oczyszczono z surowicy odpornościowej przy użyciu zestawu do oczyszczania ImmunoPure IgG (Protein A) (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Próby zubożania i immunoprecypitacji. Neutrofile stymulowano i poddawano lizie (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 1% Triton X-100, 0,5% Igepalu, 150 mM NaCl, 20 mM NaF, 0,2 mM ortowanadanu sodu, mM EDTA, mM EGTA). P38. został pozbawiony lizatów pełnokomórkowych (500. l) zawierających 100. g białka komórkowego w połączeniu z 5. g oczyszczonej anty-pełnej długości p38. obracane przez 6 lub 12 godzin w temperaturze 3 ° C. Kompleksy immunologiczne związano przez dodanie 30 ul Aefarozy białka A i obracano przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze 3 ° C. Związaną Sepharose usunięto przez odwirowanie (14,000 g przez 15 s). Oczyszczone supernatanty poddano analizie Western blot. The p38. i p38. związaną z Sepharose przemyto dwukrotnie buforem do lizy i raz w PBS, a następnie poddano analizie Western blot. Bloty zostały sondowane dla p38. używając anty-p38. (C20) przeciwciało (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, Kalifornia, USA) i dla p38. używając anty-p38. (peptyd) antysurowice. Fosforylacja tyrozyny p38. i p38. oznaczono metodą immunoblotingu z przeciwciałem przeciw fosfotyrozynie (klon 4G10; Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, New York)
[podobne: żel pod prysznic bez sls, bodyspace efekty, zapotrzebowanie na białko ]
[przypisy: żel pod prysznic bez sls, stosowanie tabletek antykoncepcyjnych, solarium tychy ]