Ratowanie odporności przeciwdrobnoustrojowej za pośrednictwem limfocytów T CD8 z nieswoistym bodźcem zapalnym cd

Siedemdziesiąt dwie godziny po zakażeniu usunięto śledziony i wątroby, a liczbę żywych bakterii w tych narządach oceniano przez homogenizację tkanek za pomocą siatki drucianej w PBS zawierającym 0,05% Triton X-100. Następnie podwielokrotności umieszczono na płytkach agarowych do infuzji mózgu i serca (Life Technologies Inc.) i CFU policzono po 24. 48 godzinach inkubacji. Podawanie mAb in vivo. MAb anty-CD40 oczyszczono z hybrydoma FGK-45, a 100 .g wstrzyknięto dootrzewnowo myszom biorcom we wskazanych punktach czasowych. Wyniki Charakteryzacja linii CD8 CTL specyficznej wobec epitopu in vitro. Aby scharakteryzować zdolność przyjmowanych komórek T CD8 do nadawania odporności ochronnej, wygenerowaliśmy specyficzne dla LLO91-99y linie komórek T CD8 przez stymulację peptydem in vitro. Epitop ten wywołuje immunodominującą odpowiedź komórek T ze złożonym repertuarem TCR (29). Poprzednie prace wskazywały, że stan aktywacji może wpływać na zdolność komórek T CD8 do nadawania odporności ochronnej (29, 30). Dlatego scharakteryzowaliśmy linie CTL CD8 specyficzne dla LLO91-99a poprzez barwienie powierzchniowe dla markera aktywacyjnego i oceniano ich funkcję efektorową za pomocą testów cytolitycznych i barwienia wewnątrzkomórkowych cytokin. Ustaliliśmy również ich TCR V. repertuar po stymulacji in vitro. Ponad 97% specyficznych dla epitopów CTL CD8 wyrażało niskie poziomy CD62L i wysokie poziomy CD44 i CD25 (Figura 1a). Testy cytotoksyczności z miareczkowaniem docelowego peptydu wykazały wysoki stopień swoistej lizy, jak również czułości peptydu, które były porównywalne z obserwowanymi po krótkotrwałej restymulacji in vitro pierwotnych i specyficznych komórek T LLO91-99y (31) (fig. 1b). Wewnątrzkomórkowe wybarwianie cytokiną wykazało, że cała populacja CTL CT8 i IFN specyficznie ekspandowanych in vitro p LLO91-99 p (Figura 1c). Po dwóch restymulacjach in vitro V. repertuar linii komórek T zachowywał rozkład podobny do obserwowanego w komórkach T specyficznych wobec LLO91-99y poddanych reakcjom przypominającym in vivo (29) (Figura 1d). Podsumowując, te wyniki charakteryzują CTL CT8 ekspandowane in vitro jako populację specyficznych wobec epitopu, efektorowych komórek T o szerokim repertuarze TCR. Figura Wektory in vitro. Ekspandowane LLO91-99. CD8 CTL mają fenotyp efektorowy i zachowują zróżnicowany TCR V. repertuar 7. 14 dni po drugiej stymulacji in vitro APC z pulsów peptydowych. (a) linia CTL CD8 wybarwiona mAb dla tetramerów CD8a, CD62L, Thy1.1, CD44, CD25 i H2-Kd skompleksowanych z LLO91-99. Lewy panel: Wykres punktowy bramkowany na żywo na limfocytach T CD8 i Thy1.1. Środkowe i prawe panele: Plamy kropkowe bramkowane na żywych komórkach T CD8. Liczby w wyższych kwadrantach przedstawiają wartości procentowe wszystkich komórek T CD8. (b) Procentową specyficzną lizę specyficzną dla LLO91-99a linii CD8 CD8 w obecności różnych stężeń peptydu LLO91-99 oznaczono za pomocą testu uwalniania 51Cr przy użyciu komórek docelowych P815 (H2d). (c) TNF i IFN-y wytwarzanie linii CD8 CTL oceniano za pomocą standardowego wewnątrzkomórkowego barwienia cytokiną po stymulacji in vitro. (d) CD8 Linię CTL wybarwiono dla TCR V. ekspresja z przeciwciałami specyficznymi dla TCR Vy. Wskazano odsetek specyficznych dla LLO91-99 (3 CTL CD8 barwionych każdym z przeciwciał TCR. Dane są reprezentatywne dla dwóch niezależnych doświadczeń. Następnie badaliśmy szybkość regeneracji CTL CT CD8 ekspandowanych in vitro po przeniesieniu do naiwnych, syngenicznych myszy biorcy. Rozbieżność Thy1 między linią CTL (Thy1.2) a odbiorcami (Thy1.1) pozwoliła nam śledzić przesyłane komórki. Z 6 × 106 specyficznych dla LLO91-99a CTL przeniesionych 2. 3 dni wcześniej, około 2,5 x 104 CTL swoistych wobec epitopów odzyskano ze śledziony biorcy, gdzie stanowiły 0,3. 0,4% całkowitej populacji komórek T CD8. Siedem dni po przeniesieniu liczby te pozostały zasadniczo niezmienione (rys. 2, aib). Co ciekawe, przeniesione CTL nie uległy proliferacji w obrębie naiwnego biorcy, co wykazano przez ich wysoką fluorescencję CFSE 72 godziny po przeniesieniu (Figura 2c). Podczas gdy przeniesione komórki T pozostały na niskim poziomie CD62L i CD44-poziom, ich poziom ekspresji CD25 zmniejszał się w porównaniu z liniami komórek T utrzymywanymi in vitro (Figura 2d). Figura 2CD8 CTL zachowują fenotyp efektorowy i nie proliferują po przeniesieniu do naiwnych, syngenicznych biorców. (a) d) Trzy i siedem dni po przeniesieniu CTL CTX 6 x 106 Thy1.1 do biorców BALB / c Thy1.2, splenocyty wybarwiono dla CD8a, Thy1.1, CD44, CD25 i LLO91-99 H2. -Kd tetramery. (a) Wykresy punktowe są bramkowane na żywych komórkach T CD8, a odsetek komórek dodatnich dla Thy1.1 (oś y) i LLO91-99 (oś x) jest pokazany
[przypisy: właściwości olejku rycynowego, ośrodki terapii uzależnień, stosowanie tabletek antykoncepcyjnych ]
[przypisy: kalkulator kalorii na mase, kalkulator zapotrzebowania kalorycznego na mase, odkwaszanie organizmu przepisy ]