Ratowanie odporności przeciwdrobnoustrojowej za pośrednictwem limfocytów T CD8 z nieswoistym bodźcem zapalnym ad

Szczep L. 10403S L. monocytogenes (uzyskany od Daniela Portnoya, University of California, Berkeley, Berkeley, Kalifornia, USA) i zmutowany szczep L. monocytogenes LLOSer92 (mutacja tyrozyny w pozycji 92 listeriolizyny do seryny) (26) hodowano w bulion do infuzji mózgu i serca. Immunizacja myszy za pomocą L. monocytogenes i generowanie specyficznych dla LLO linii komórek T CD8. Myszy BALB / c myszy Thy1.2 immunizowano przez dożylne wstrzyknięcie 2 × 103 litrów. monocytogenes do bocznej żyły ogonowej. Śledziony usunięto 7. 10 dni po immunizacji, a splenocyty zebrano przez dysocjację przez siatkę drucianą i lizę erytrocytów za pomocą chlorku amonu. Splenocyty ponownie zawieszono w RP10 +, składającym się z RPMI 1640 (GIBCO BRL, Life Technologies Inc. Gaithersburg, Maryland, USA) uzupełnionej 10% FCS, L-glutaminą, HEPES (pH 7,5), P-merkaptoetanolem, penicyliną (100 U / ml ), streptomycyny (100 .g / ml) i gentamycyny (50 .g / ml). Inkubowaliśmy splenocyty 40 x 106 odpowiadające w obecności napromieniowanych, syngenicznych splenocytów 30 x 106, które były peptydowo pulsowane przez godzinę w 37 ° C z 10. 9 M peptydu LLO91-99. Linie komórkowe hodowano w 10 ml pożywki RP10 + suplementowanej 0,5 ng / ml IL-2 i 4 ng / ml IL-7 (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA). Po 7 dniach limfocyty T odpowiadające ponownie stymulowano, jak opisano powyżej. Jeden do dwóch tygodni po drugiej ponownej stymulacji in vitro, CTL CT CD8 przemyto PBS i ponownie zawieszono w stężeniu 6 x 106 CDL CTL swoistych dla epitopów na 250 ul PBS do wstrzyknięcia myszom syngenicznym. Tetrameryczne kompleksy peptydowe H2-Kdc. Tetramery peptydu MHC do barwienia swoistych wobec epitopu komórek T wytworzono zgodnie z wcześniejszym opisem (27). Barwienie i analiza cytometrii przepływowej. Sto tysięcy CD8 CTL z hodowli komórek T lub splenocytów 2 x 106 dodano do studzienek 96-dołkowej płytki. Po inkubacji w temperaturze 4 ° C przez 20 minut z nieskoniugowaną streptawidyną (0,5 mg / ml, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA) i blokiem Fc (BD PharMingen, San Diego, Kalifornia, USA) w buforze do barwienia FACS (SB: PBS [pH 7,45] 0,5% BSA i 0,02% azydek sodu), komórki zabarwiono skoniugowanym z FITC anty-CD62L (BD PharMingen), skoniugowanym z fikoerytryną tromamerem H2-Kd LLO91-99 (0,25 . 0,5 mg / ml), perydynina, sprzężone z białkiem chlorofilowym. anty-Thy1.1 (BD PharMingen) i anty-CD8 skoniugowane z allofikocyjaniną. (BD PharMingen) w SB przez 60 minut w 4 ° C. Komórki zabarwiono również koniugatem FITC lub sprzężonym z fikoerytryną anty-CD25 lub anty-CD44 i skoniugowanym z FITC receptorem V. (anty-TCR V.) (TCR V. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,1, 8,2, 8,1. 8,3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17). Następnie komórki przemyto trzy razy w SB i następnie utrwalono 1% paraformaldehydem / PBS (pH 7,4). Przeprowadzono czterokolorową cytometrię przepływową przy użyciu cytometru przepływowego FACSCalibur lub LSR, a dane analizowano za pomocą oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems Mountain View, California, USA). Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin. Jeden do dwóch tygodni po drugiej stymulacji in vitro, 5 x 106 CD8 CTL na mililitr RPMI + inkubowano przez 5 godzin w 37 ° C i 5% CO2 z ug / ml brefeldiny A (BD PharMingen) w 24-dołkowej płaskiej -dolna płytka pokryta mAb anty-CD3 (10 .g / ml) (BD PharMingen). Komórki utrwalono przez inkubację z Cytofix / Cytoperm (BD PharMingen) w 4 ° C przez 20 minut. Następnie komórki przemyto dwukrotnie buforem Perm / Wash (BD PharMingen) i barwiono w temperaturze 4 ° C przez 30 minut sprzężonym z FITC anty-IFN-a, skoniugowanym z FITC anty-TNF lub skoniugowanym z FITC testem izotypu IgG1. . Na koniec, komórki ponownie przemyto x Perm / Wash Buffer i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w FACS SB do analizy metodą cytometrii przepływowej. Testy CTL. Standardowe testy uwalniania Cr z użyciem komórek docelowych P815 znakowanych 51Cr przeprowadzono jak opisano wcześniej (28). W celu miareczkowania peptydów określono procentową specyficzną lizę w zakresie różnych stężeń peptydów przy stałym stosunku efektor do celu w przybliżeniu 20: 1. Oznaczanie estru dioctanowego kwasu sukkarimidylowego karboksyfluoresceiny. CTL CT CD8 przemyto PBS i ponownie zawieszono w stężeniu 5 x 107 na mililitr w PBS zawierającym ester metylowy 1. M kwasu sukcynimidowego dioctanu karboksylazyny (CFSE, Molecular Probes Inc.). Zawiesinę komórek inkubowano w 37 ° C, 5% CO2 przez 10 minut i natychmiast przemyto zimnym RPMI 1640/10% FCS przed przeniesieniem do myszy. Zakażenie myszy L. monocytogenes, pobranie śledziony i oznaczenie ilościowe bakterii. Trzydzieści minut, 48 godzin lub 7 dni po przeniesieniu CTL CTL Thy1.1 CD8 6 × 106 LLO91-996, myszy biorcy Thy1.2 zostały zainfekowane 5 × 103L. monocytogenes 10403S lub LLOSer92 poprzez boczne wstrzyknięcie do żyły ogonowej
[więcej w: apteczka pierwszej pomocy nie powinna zawierać, body space tychy, ośrodki terapii uzależnień ]
[patrz też: body space tychy, space tychy, medycyna pracy nysa ]