Niehamujący mutant domeny rusztowania jaskini-1 wzmacnia syntezę NO pochodzącą z eNOS i rozszerzenie naczyń u myszy cd

Ponieważ jest możliwe, że endogenny Cav-1 może uratować potencjalny defekt spowodowany przez podstawienie F92A, powtórzyliśmy powyższe eksperymenty w komórkach HEK293 wyrażających niższe endogenne poziomy Cav-1 i uzyskano podobne wyniki (Figura 2B). Wykorzystując wirowanie z sedymentacją prędkości, która oddziela białka według ich natywnych mas cząsteczkowych i kształtów, WT i F92AAAlc-1 współdyfundowano z endogennym Cav-1 (Figura 2C), co odpowiada około 10 monomerom Cav-1 w oligomerycznym kompleksie. Identyczne wyniki uzyskano w odtworzonym układzie (rysunek 2D). Dane te sugerują, że podstawienie F92A nie zakłóca 2 podstawowych biochemicznych właściwości Cav-1, lokalizacji i oligomeryzacji. Rycina 2F92A i WT Cav-1 wykazują podobne właściwości biochemiczne. (A) BAEC infekowano adenowirusami (25 MOI) kodującymi WT (znakowany myc) i F92AA Cav-1 (znakowany HA) przez 48 godzin i lizaty poddawano frakcjonowaniu gradientu sacharozy. Górny panel przedstawia względny rozkład białek w gradiencie (oznaczany ilościowo przez densytometrię), a dolne panele pokazują poziomy endogennego Cav-1 (góra), WT Cav-1 (myc), F92AA Cav-1 (HA) i HSP90 as kontrola Analiza immunoblotu z zebranych frakcji. Frakcje 2 do 5 reprezentują frakcje pływające, CEM i frakcje 8-12 masowo białek z HSP90 jako markerem. (B) Komórki HEK293 transfekowano cDNA WT i F92A. Cav-1 i lizaty poddano frakcjonowaniu sacharozą i metodą Western blot, jak w A. (C) BAEC infekowano jak opisano w A, poddano lizie i poddano wirowaniu z gradientem szybkości w celu porównania względna masa cząsteczkowa oligomerów kontenerowych Cav-1. (ilościowo określone przez densytometrię powyżej). Gradienty skalibrowano znanymi standardami MW. Frakcje wymazano na endogenny Cav-1 (góra), WT Cav-1 (środkowy) i F92A A Cav-1 (na dole). Szczytowy poziom Cav-1 był we frakcji 6, co odpowiada ponad 10 monomerom Cav-1 (każdy monomer w 22 kDa). (D) Ekspresja cDNA WT i F92AA-Cav-1 w komórkach HEK293, które wyrażają niskie poziomy endogennego Cav-1. Próbki przetwarzano jak opisano w C. Podobne wyniki uzyskano w 2 dodatkowych doświadczeniach. F92A (3-Cav-1 kolokalizuje i współdziała z eNOS podobnie jak WT Cav-1, ale uwalnia eNOS z hamującego clamp endogennego Cav-1. Chociaż substytucja F92A pogarsza zdolność Cav-1 do hamowania eNOS (23), testowaliśmy w celu ustalenia, czy ta reszta jest ważna dla wiązania Cav-1 z eNOS poprzez przeprowadzanie doświadczeń z pull-down glutationo-S-transferazy (4). , 25). Oczyszczone GST, GSTA Cav-1 (aa 61 A 101) i zmutowane białka GSTa F92AAAc-1 (aa 61 A 101) eksprymowano i oczyszczono z E. coli i inkubowano z solubilizowanym eNOS wytworzonym z lizatów EC. Solubilizowany eNOS oddziałuje z GST-.-Cav-1 i GST-F92AA-Cav-1 podobnie, ale nie z samym GST (Figura 3A). Podobne dane uzyskano przy użyciu nieacylowanego, rekombinowanego eNOS oczyszczonego z E. coli (dodatkowa postać 1A, materiał dodatkowy dostępny online z tym artykułem; doi: 10,1172 / JCI44778DS1). W związku z tym sugeruje to, że wzrost uwalniania NO obserwowany w przypadku F92A (3-Cav-1 w komórkach wykazujących ekspresję eNOS wynika z jego zdolności do wiązania antagonistów eNOS i y. hamujący zacisk endogennego Cav-1 w kierunku eNOS. Aby przetestować ten pomysł biochemicznie przeprowadzono rekombinacyjne testy aktywności eNOS. W warunkach ograniczonej inhibicji eNOS przez immobilizowany GST a Cav-1 (figura 3B, 100% aktywności), kwantyfikacja konwersji l-argininy do produktu ubocznego l-cytruliny jako bezpośredniego testu eNOS ujawniła, że dalsze dodawanie rozpuszczalnego GST. Cav-1 znacznie zmniejszał aktywność eNOS, zgodnie z oczekiwaniami, podczas gdy dodatek rozpuszczalnego GSTa F92AA-Cav-1 zwiększał aktywność eNOS w porównaniu z warunkami kontrolnymi (Figura 3B). W celu zbadania, czy podstawienie F92A wpłynęło na połączenie eNOS z innymi aktywatorami szlaku, takiego jak CaM i Hsp90, porównywano wiązanie eNOS z GSTAl Cav-1 w porównaniu z GST a F92AAcc-1 przy użyciu odtworzonego układu jak opisano poprzednio. (26). Interakcję eNOS i Hsp90 z GST-a-Cav-1 względem GST-F92AA-Cav-1 oceniano przy rosnącym stężeniu CaM aktywowanego wapniem (0, 0,01, MM). Jak pokazano na Figurze 3C, kompleks eNOS-Hsp90 oddziałuje zarówno z GST a Cav-1 i GST a F92AA Cav-1, a także jest przemieszczany w tym samym stopniu przez CaM. Łącznie, te dane uzyskane z zastosowaniem oczyszczonych białek potwierdziły, że F92AA-Cav-1 może zwiększać aktywność eNOS w obecności inhibitora WT Cav-1 i może być regulowany przez podobne mechanizmy aktywacji eNOS. Figura 3F92A (3-Cav-1 oddziałuje z eNOS i zapobiega hamowaniu eNOS przez Cav-1
[patrz też: ile kalorii ma mozzarella, just fit, ośrodki terapii uzależnień ]
[podobne: body space tychy, space tychy, medycyna pracy nysa ]