Niehamujący mutant domeny rusztowania jaskini-1 wzmacnia syntezę NO pochodzącą z eNOS i rozszerzenie naczyń u myszy ad 7

Oczywiste jest, że przyszłe badania mające na celu optymalizację Cavnoxin i potencjalnej konstrukcji małocząsteczkowej na bazie Cavnoxin dostarczyłyby nowych możliwości poprawy funkcji śródbłonka. Metody Kultura komórkowa. BAEC poniżej pasa 15, komórki COS i komórki HEK hodowano w DMEM (Invitrogen) uzupełnionym 5% FBS i x penicyliną / streptomycyną w nawilżonym inkubatorze w 37 ° C z 7% CO2 jak opisano. Transfekcja komórek i infekcja. Transfekcję komórek przeprowadzono jak opisano wcześniej (23). Ilości plazmidów znormalizowano w celu zapewnienia równych ilości DNA. Białka komórkowe izolowano 48 godzin później dla eksperymentów z odpowiednim buforem. W celu zakażenia komórek semikonfluentne BAEC hodowane w 100-mm naczyniu do hodowli tkankowej infekowano adenowirusami kodującymi WT Cav-1 (myc-tag) i F92AA-Cav-1 (znacznik HA). Białka komórkowe wyizolowano 48 godzin później dla eksperymentów. Peptydy zaprojektowano i zsyntetyzowano zgodnie z wcześniejszym opisem (23). Cavnoxin odnosi się do zmutowanego peptydu CSD (DGIWKASFAAATVTKWYFYR) połączonego z AP (RQIKIWFQNRRMKWKK). Izolacja trat kawalerskich / lipidowych, akumulacja NO i aktywność eNOS. Izolacja tratoli jamowo-lipidowych została przeprowadzona metodą frakcjonowania bez detergentu, jak opisano wcześniej (1, 23). Traktowanie komórek i oznaczanie ilościowe uwalniania NO (mierzone jako azotyn) przeprowadzono jak opisano wcześniej (23) za pomocą analizatora chemiluminescencyjnego specyficznego dla NO (NOAi, GE). Oznaczenie ilościowe NO-specyficzne dla NO zostało potwierdzone przez zapewnienie, że ponad 95% odpowiedzi zostało zablokowanych przez inhibitor NOS L-NAME. Testy aktywności eNOS przeprowadzono jak opisano wcześniej (26). Odwirowanie z gradientem prędkości. Komórki (2 konfluentne 100-mm płytki) poddano lizie z 500 .l soli fizjologicznej buforowanej mezem (MBS; 25 mM Mes, pH 6,5 / 0,15 M NaCl) / 60 mM P-oktylo-glukozydu. Komórkowe agregaty zdysocjowano przez sonikację (trzy 10-sekundowe impulsy), a następnie solubilizowany materiał naniesiono na gradient 5%. 45% ciągłego sacharozy wytworzony w MBS / 60 mM y-oktylo glukozyd (12 ml) i odwirowano przy 80 000 g przez 16-20 godzin. Po odwirowaniu z gradientu zebrano dwanaście 1-ml frakcji i przeprowadzono analizę Western blot. Aby lepiej oszacować masę cząsteczkową białek z gradientu, wirowanie z gradientem prędkości przeprowadzono na 5 wzorcach masy cząsteczkowej: tyreoglobulinie (670 kDa), apoferrytynie (480 kDa), katalazie (250 kDa), BSA (66 kDa), i anhydraza węglanowa (29 kDa). Oczyszczanie białek fuzyjnych GSTA-Cav-1 (WT i F92AA-Cav-1) i oddziaływania in vitro. Ekspresję białka fuzyjnego Caveolin przeprowadzono jak opisano wcześniej (4, 25, 26). W celu określenia wiązania GSTA-Cav-1 i GST-F92AA-Cav-1 do eNOS, przeprowadzono test rozciągania GST z użyciem lizatów BAEC. Komórki poddano lizie w buforze STET (50 mM Tris-Cl, pH 7,4, 150 mM NaCl, mM EDTA, 1% Triton X-100) zawierającym x inhibitory proteazy i mM PMSF. Próbki homogenizowano Dounce (20 uderzeń) i bębnowano przez godzinę w 4 ° C. Następnie próbki odwirowano przez 10 minut przy 5000 g w 4 ° C, poddano działaniu ultradźwięków (trzy 10-sekundowe impulsy) i inkubowano przez noc w 4 ° C z perełkami zawierającymi sam GST, GST a Cav-1 lub GST a F92A. Cav-1 (~ 80 ul upakowanej objętości) w całkowitej objętości 500 ul. Po związaniu perełki przemywano (trzy 5-minutowe interwały) buforem do płukania zawierającym 50 mM Tris-Cl (pH 7,4), 125 mM NaCl, mM EDTA i mM EGTA. Ponadto, przeprowadzono interakcje in vitro GST a Cav-1 i GST a F92AA Cav-1 z rekombinowanym eNOS (Cayman Chemicals), jak opisano wcześniej (26) przez 2 godziny w 4 ° C w buforze wiążącym (50 mM Tris- Cl, pH 7,4, w 20% glicerolu). Po związaniu perełki przemyto (pięć 5-minutowych odstępów) buforem do przemywania o wysokiej zawartości soli (50 mM Tris-Cl, pH 7,7, 400 mM NaCl i mM EDTA). Kulki wymywano przez gotowanie w buforze do próbek x SDS i poddawano elektroforezie żelowej SDS / PAGE, a następnie metodą Western blot z przeciwciałami anty-GST i anty-eNOS. Swoistość interakcji z domeną rusztowania Cav-1 (aa 82 A 101) została potwierdzona przez brak interakcji eNOS z samym GST, GST a Cav-1 (aa 61. 81) lub GSTA Cav-1 (aa 61). Y81) połączony z sekwencją polialaniny 20a. Immunofluorescencja. Eksperymenty immunofluorescencji przeprowadzono na BAECs zainfekowanych adenowirusami Cav-1 WT i F92A. BAEC wysiewano w szkiełkach nakrywkowych żelatynowych i infekowano jak opisano powyżej. Czterdzieści osiem godzin po rozpoczęciu infekcji, barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono jak opisano wcześniej (23) i wizualizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. W przypadku badań wychwytu, BAEC inkubowano z Cavnoxinem znakowanym rhamaminą do 6 godzin w stężeniu 10 .m, a następnie płukano i wizualizowano
[więcej w: lekarz medycyny pracy nysa, solarium tychy, kapsuła tychy ]
[patrz też: przepis na chleb bez zakwasu, choleryk z brooklynu cda, tabletki na nerwy bez recepty ]