Limfocyty T regulatorowe CD4 + CD25 + hamują odrzucanie alloprzeszczepu, w którym pośredniczą limfocyty T pamięci CD8 + za pośrednictwem mechanizmu zależnego od CD30 cd

Komórki następnie utrwalono w 70% etanolu, a następnie 1% paraformaldehydzie i inkubowano z 50 U / ml DNazy I (Sigma-Aldrich). Komórki ostatecznie wybarwiono anty-BrdU . FITC (BD Biosciences) i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. W celu wykrycia apoptozy komórki infiltrujące przeszczep umieszczono w 2% paraformaldehydzie, permeabilizowano 0,1% roztworem Triton X-100 i znakowano znakowanym fluoresceiną dUTP metodą TUNEL zgodnie z instrukcjami producenta (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis , Indiana, USA). Analiza proliferacji komórek T pamięci i apoptozy in vitro. Oczyszczone komórki limfocytów T CD8 + (CD8 + CD44high) hodowano z komórkami Treg w stosunku 1: 2 (Treg / pamięć) w 24-dołkowych płytkach i transwell (Corning-Costar Corp., Cambridge, Massachusetts, USA) w kompletnym RPMI -1640 pożywki (10% FCS, 2 mM glutaminy, 100 U / ml penicyliny i 100 ug / ml streptomycyny). Napromieniowane komórki śledziony BALB / c również dodano do hodowli, aby służyły jako APC. MAb anty-FasL zakupiono od firmy Pharmingen. Czterdzieści osiem godzin później komórki analizowano pod kątem apoptozy metodą TUNEL. Aby zmierzyć proliferację limfocytów T, komórki hodowano w 96-studzienkowych płytkach i pulsowano [3H] -TdR przez ostatnie 6 godzin. Komórki następnie zebrano i analizowano za pomocą licznika scyntylacyjnego (Perkin-Elmer Inc., Wellesley, Massachusetts, USA). Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin. Aby określić profil cytokin Treg, komórki T śledziony zabarwiono najpierw na markery powierzchniowe anty-CD4 (3-PE i anty-CD25a-FITC. Następnie komórki utrwalono 2% paraformaldehydem, permeabilizowano w 0,5% saponinie przed barwieniem anty-IL-2A APC lub anty-IL-10P APC (Pharmingen). Aby zmierzyć przywołanie pamięci, komórki T pamięci CD8 +, które hodowano przez 48 godzin, najpierw znakowano anty-CD8aEF i anty-CD44a biotyną (Pharmingen), a następnie streptawidyną-PerCP. Komórki następnie utrwalano, permeabilizowano i barwiono anty-IFN-aFITC, a na koniec analizowano za pomocą FACSCalibur (BD Biosciences). Wyniki Wywołane antygenem komórki Treg CD4 + CD25 + tłumią odrzucanie alloprzeszczepu za pośrednictwem limfocytów T pamięci CD8 +. Niedawno opracowaliśmy model odrzucania alloprzeszczepu, w którym pośredniczą limfocyty T pamięci u splenektomizowanej myszy limfatycznej (28). Spineektomiczna mysz pozbawiona jest drugorzędowych narządów limfoidalnych, nie wywołuje pierwotnej odpowiedzi immunologicznej i nie odrzuca alloprzeszczepu, chyba że otrzymuje efektorowe lub pamięciowe komórki T od kongenicznej myszy B6 immunizowanej antygenami dawcy (28, 29). Ponadto, proliferacja homeostatyczna wywołana limfopenią, obserwowana u gospodarzy z niedoborem komórek T, takich jak Rag. /. i myszy SCID, nie występują u splenektomizowanych myszy aly (30). Dlatego zjawiska komórek Treg można rzetelnie badać w splenektomizowanym gospodarzu bez zakłócających efektów homeostatycznej proliferacji. Aby sprawdzić, czy komórki Treg tłumią odpowiedź aloimmunologiczną, w której pośredniczą komórki T pamięci CD8 +, splenektomiczne myszy aly przeszczepiono skórką BALB / c. Dzień później, myszy biorcy otrzymały komórki T CD8 + pamięci i / lub komórki Treg. Jak pokazano na Figurze 1a, komórki T CD8 + pamięci specyficzne dla dawcy generowane w WT lub transgenicznym 2C.Rag. /. myszy odrzucały alloprzeszczepy skóry u splenektomizowanych myszy aly. Naiwne limfocyty T CD8 + lub nieistotne komórki T CD8 + pamięci wygenerowane przeciwko antygenom trzeciej strony (H-2k) nie odrzuciły alloprzeszczepów, co wskazuje, że tylko komórki T CD8 + pamięci specyficzne dla dawcy pośredniczą w odrzuceniu w tym modelu. Co ważne, komórki Treg z myszy traktowanych DST, ale nie naiwne, myszy WT znacząco opóźniły odrzucenie alloprzeszczepu, gdy kot ulegał translacji z limfocytami T CD8 + z pamięcią (Figura 1b). Średni czas przeżycia allograftu wynosił 22 dni w grupie, która otrzymywała specyficzne dla donora komórki T pamięci same (M), 24 dni w grupie, która otrzymała specyficzne dla dawcy komórki T pamięci plus naiwne komórki Treg (M + naiwny Treg), i 60 dni w grupie, która otrzymała komórki T pamięci specyficzne dla dawcy plus komórki Treg indukowane DST (M + DST Treg). Przeciwnie, komórki Treg u myszy otrzymujących transfuzję splenocytów od strony trzeciej (H-2k) (M + TPT Treg) nie powodowały istotnego tłumienia odrzucenia alloprzeszczepu. Jako kontrolę transfer samych albo naiwnych, albo indukowanych DST komórek Treg sam nie powodował odrzucenia alloprzeszczepu (Figura 1b). Dane te wskazują, że indukowane antygenem, ale nie naiwne komórki Treg są zdolne do hamowania rekombinacji komórek T CD8 + w sposób allospecyficzny. Figura Komórki Treg indukowane autogenem tłumią odrzucenie alloprzeszczepu za pośrednictwem limfocytów T pamięci CD8 +. (a) Splenektomiczne myszy alfa (H-2b), przeszczepione dzień wcześniej za pomocą przeszczepów skóry BALB / c (H-2d), otrzymały x 106 naiwnych komórek T CD8 + z myszy WT B6 (H-2b) (otwarte trójkąty, n = 5) lub myszy 2C (otwarte romby, n = 5); lub x 106 komórek CD8 + pamięci od myszy WT B6 immunizowanych splenocytami specyficznymi dla dawcy (H-2d) (kwadraty, n = 8) lub limfocytami śledzionowymi osób trzecich (H-2k) (otwarte trójkąty odwrócone, n = 6) lub od myszy 2C immunizowanych splenocytami specyficznymi dla dawcy (wypełnione romby, n = 6)
[podobne: just fit, żel pod prysznic bez sls, szlifowanie stali nierdzewnej ]
[podobne: kalkulator zapotrzebowania kalorycznego na mase, odkwaszanie organizmu przepisy, apteczka pierwszej pomocy nie powinna zawierać ]