Limfocyty T regulatorowe CD4 + CD25 + hamują odrzucanie alloprzeszczepu, w którym pośredniczą limfocyty T pamięci CD8 + za pośrednictwem mechanizmu zależnego od CD30 ad

Myszy C57BL / 6 (B6) homozygotyczne pod względem mutacji prowadzącej do limfoblastii (aly) zakupiono od CLEA Japan Inc. (Osaka, Japonia) (25). 2C myszy transgeniczne B6 TCR na rekombinacyjnym-aktywującym genu-2 nokaut (Rag2a / a) tła (2C.Rag A / P) wytworzono przez krzyżowanie wsteczne transgenicznych myszy 2C na Rag2a / r. myszy (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA). CD30. /. Kolonia myszy B6 była prezentem od Tak Mak (University of Toronto, Toronto, Ontario, Kanada). Myszy WT BALB / c, myszy WT C3H / HeJ i myszy WT B6 zakupiono w The Jackson Laboratory. Wszystkie myszy były trzymane w określonym środowisku wolnym od patogenów, a protokoły dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Pielęgnowania i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Yale University. Operacja myszy. Dawcy skóry i serca byli 6- do 8-tygodniowymi myszami BALB / c (H-2d), a biorcami aloprzeszczepu były 6- do 8-tygodniowe splenektomiczne myszy B6 splenektomizowane lub myszy WT B6 (H-2b). Splenektomię wykonano 2 tygodnie przed przeszczepem. W pełni unaczyniony heterotopowy przeszczep serca przeprowadzono zgodnie z opisem (26). Odrzucenie aloprzeszczepu serca zdefiniowano jako przerwanie wyczuwalnych skurczów mięśnia sercowego. Skórę tułowia pełnej grubości przeszczepiono do grzbietowej powierzchni bocznej myszy biorcy. Odrzucenie skóry zdefiniowano jako martwicę przeszczepu większą niż 90%. Treg i pamięć komórek T przygotowanie i fenotypowanie. W celu indukcji swoistych antygenowo komórek Treg, WT lub CD30a /. Myszy B6 traktowano transfuzją splenocytów specyficznych od dawców (DST) za pomocą napromieniowanych komórek śledziony BALB / c, traktowano trzeciorzędową transfuzją splenocytów (TPT) stosując napromienione komórki śledziony C3H / HeJ lub pozostawiono bez iniekcji. Cztery tygodnie później, komórki śledziony połączono i wzbogacono w komórki T CD4 + przez pozytywną selekcję na separatorze komórek magnetycznych (autoMACS, Miltenyi Biotec Inc., Auburn, California, USA). Komórki następnie wybarwiono przeciwciałem anty-CD4y-fikoerytryną (anty-CD4-PE) i anty-CD25a-FITC, a komórki Treg CD4 + CD25 + sortowano przy użyciu urządzenia FACSVantage (BD Biosciences, Mountain View, California, USA). Czystość komórek CD4 + CD25 + była większa niż 95%. W celu fenotypowania Treg komórki wybarwione przeciwciałami anty-CD4yE i anty-CD25a-FITC znakowano następnie antybiotyną skierowaną przeciw CD30. Biotinie lub anty-CTLA4Pa-biotyną, a następnie streptawidynopirydynoiną, białkiem chlorofilu-a (streptawidyna). -PerCP) lub znakowane anty-CD62L-a-allofikocyjanina lub anty-CD45RBa (3-biotyny Ab, a następnie streptawidyna-allofikocyjanina (wszystkie Ab były z firmy Pharmingen, San Diego, Kalifornia, USA). Komórki T pamięci CD8 + oczyszczono z WT, CD30a / y lub transgenicznego 2C.Rag. /. myszy 10 tygodni po DST lub TPT (1 x 107 komórek na mysz) przez autoMACS i FACSVantage. W skrócie, komórki T CD8 + wyizolowano najpierw z komórek śledziony przez autoMACS, stosując selekcję pozytywną. Komórki następnie inkubowano z przeciwciałami anty-CD8 (3A i anty-CD44F-Ab (Pharmingen) i sortowano za pomocą FACS po bramkowaniu populacji CD8 + CD44high. Czystość tych komórek była typowo większa niż 95% dla komórek WT i większa niż 94% dla komórek 2C. Fenotyp pamięci został następnie potwierdzony przez wybarwienie anty-CD62LP APC i anty-CD25P APC (Pharmingen). Leczenie myszy. Aby zablokować kostymulację CD28 / B7 i CD40L / CD40L, a zatem tłumić podstawową odpowiedź alloimmunologiczną, myszom WT wstrzyknięto dootrzewnowo zarówno CTLA4-Ig (0,5 mg w dniu 2), jak i MR1 (0,25 mg w dniach 0, 2, 4 i 6). ) po transplantacji. Obaj agenci dostarczył Christian Larsen (Emory University, Atlanta, Georgia, USA). Aby zablokować interakcję CD30 / CD30L, myszom wstrzyknięto dootrzewnowo przeciwciało blokujące Ab-CD30L (Pharmingen) lub kontrolne izotypowe Ab (szczurzy IgG2b) (0,1 mg w dniach 0, 2, 4 i 6 po transplantacji). Izolacja komórek infiltrujących przeszczep. Komórki infiltrowane przez przeszczep izolowano jak opisano wcześniej (27). Pokrótce, przeszczepione myszy uśmiercono, a allografty serca perfundowano in situ heparynizowanym 0,9% roztworem soli. Następnie przeszczepiano alloprzeszczepy i trawiono w 37 ° C przez 30 minut w 20 ml pożywki RPMI-1640 zawierającej 10% FCS i 250 U / ml kolagenazy (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). W celu usunięcia resztek zawiesiny komórek natychmiast przepuszczono przez luźno upakowaną kolumnę z wełny szklanej (300 mg sterylnej wełny szklanej w strzykawce o pojemności 10 ml), następnie zmieszano z roztworem Percoll (Sigma-Aldrich) do stężenia 30% i odwirowano. przy 800 g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Pelet przemyto i ponownie zawieszono przed analizą przepływu. Analiza in vivo proliferacji i apoptozy komórek T pamięci za pomocą znakowania BrdU i TUNEL. Splenektomizowane myszy aly podawano dootrzewnowo za pomocą 0,8 mg BrdU (Sigma-Aldrich) 7 dni po transplantacji. Dwadzieścia cztery godziny później izolowano komórki przeszczepiające i barwiono stosując anty-CD8PE i 1B2, a następnie anty-mysią IgGl . biotynę i streptawidynę-PerCP (Pharmingen).
[podobne: kalkulator kalorii na mase, żel pod prysznic bez sls, przepis na chleb bez zakwasu ]
[więcej w: space tychy, medycyna pracy nysa, kalkulator kalorii na mase ]